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研究背景:乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤,侵袭及转移是恶性肿瘤的基本特征,尤其在肿瘤发生、发展的最后阶段。统计学调查结果显示:乳腺癌转移是导致乳腺癌患者死亡的最主要原因。大多数恶性肿瘤在演进过程中均伴有上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)过程的发生,从而使肿瘤细胞获得干细胞特性,增强肿瘤细胞的运动、侵袭和转移能力。EMT是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。EMT在胚胎发育、慢性炎症、组织重建、癌症转移和多种纤维化疾病中发挥重要作用,其主要特征包括细胞黏附分子(如E-cadherin)表达的减少、波形蛋白(Vimentin)表达的升高及细胞形态上具有间充质细胞的特征等。EMT是一个由多种途径共同调控的过程,参与EMT过程的细胞内信号转导途径包括TGF-β/Smad途径、Wnt/β-catenin途径、受体酪氨酸激酶Ras-MAPK途径、Src激酶、Rho家族激酶、PI3K/AKT途径等。这些信号通路交互成网,通过分解上皮细胞间的连接和改变细胞极性等方式,使上皮细胞获得间质细胞的表型。参与EMT过程的转录因子主要包括Snail/Slug、Twist和NF-κB。其中,Snail和Slug属于锌指蛋白Snail超家族,通过竞争性结合E-cadherin启动子区域的E-box序列而抑制E-cadherin的表达。Twist属于碱性螺旋-环-螺旋蛋白家族,通过促进Snail的表达,从而促进细胞的EMT过程。NF-κB通过与Vimentin启动子调节序列结合,提高Vimentin的表达;此外,NF-κB可促进Twist的表达,进而促进EMT的发生。盐霉素对肿瘤细胞具有杀伤作用,是一种癌干细胞抑制剂。2009年,Gupta等人研究发现其对乳腺癌干细胞的杀灭作用是乳腺癌最常用的化疗药物紫杉醇(paclitaxel)的100倍。而盐霉素对乳腺癌侵袭和转移方面的作用尚未见报道。本研究旨在探讨盐霉素对乳腺癌MCF-7细胞侵袭和转移能力的影响以及相关机制,研究盐霉素是否对乳腺癌MCF-7细胞的EMT过程以及相关信号通路产生影响,为盐霉素的临床应用提供理论依据,为乳腺癌的复发和转移提供了新的治疗思路。方法:实验分为四组:空白处理组、TGF-β1处理组、TGF-β1+盐霉素(0.5μM)处理组、TGF-β1+盐霉素(1.0μM)处理组。(1)划痕实验检测MCF-7细胞迁移能力的变化:各处理组的MCF-7细胞无血清培养48h,分别于24h以及48h时取样拍照,测量细胞迁移距离。采用Transwell实验检测各组MCF-7细胞侵袭能力的变化:各处理组细胞分别培养24h以及48h后取样拍照,并计数其穿膜细胞数量。采用明胶酶谱技术检测各处理组MCF-7细胞内MMP-2表达水平的变化。(2)Western blot技术检测MCF-7细胞内蛋白水平的变化。检测指标包括:金属基质蛋白酶-2—MMP-2,上皮标记物—E-cadherin,间质标记物—Vimentin,TGF-β/Smad通路关键分子—p-Smad2/3,Wnt/β-catenin通路关键分子—β-catenin,MAPKs通路关键分子—p-p38 MAPK,EMT相关转录因子—Snail1。免疫细胞化学技术观察细胞内E-cadherin、Vimentin及β-catenin的表达情况,q RT-PCR技术比较各组Snail1的m RNA含量。(3)免疫组织化学方法分析55例人乳腺癌组织切片内E-cadherin和β-catenin的表达,并使用统计学软件计算二者的相关性。结果:(1)划痕及侵袭实验结果显示:TGF-β1赋予MCF-7细胞高迁移、侵袭能力,而盐霉素可以有效地抑制其迁移距离及侵袭数量。Western blot及明胶酶谱技术检测MMP-2的表达情况,结果显示:与空白对照组相比,TGF-β1处理组MCF-7细胞内MMP-2表达水平升高;与TGF-β1处理组相比,TGF-β1+盐霉素(0.5μM/1.0μM)处理组MMP-2表达水平下降。(2)通过对EMT标记物的监测发现:TGF-β1降低MCF-7细胞内E-cadherin的蛋白含量,升高细胞内Vimentin的蛋白含量,而0.5μM/1.0μM盐霉素能够逆转TGF-β1的作用。(3)EMT相关信号通路的标记物检测结果显示:与空白对照组相比,TGF-β1处理组P-Smad2/3、Snail1、β-catenin、p-p38 MAPK表达均上升,而与TGF-β1处理组相比,TGF-β1+盐霉素(0.5μM/1.0μM)处理组对应蛋白表达均下降。(4)对55例人乳腺癌标本进行E-cadherin与β-catenin的免疫组化分析,结果显示:相对于非转移性乳腺癌,淋巴结转移性乳腺癌组织内E-cadherin表达较低,β-catenin表达较高。统计软件计算结果显示:E-cadherin与β-catenin之间存在相关性,相关系数r=-0.769,P=0.033。结论:盐霉素逆转TGF-β1诱导的乳腺癌MCF-7细胞的侵袭、迁移并抑制TGF-β1诱导的MMP-2高表达。盐霉素有效逆转TGF-β1诱导的MCF-7细胞EMT过程的发生,其机制是通过抑制TGF-β1诱导的Smad以及non-Smad(包括Wnt/β-cadherin和p38 MAPK)信号通路的激活。在人乳腺癌组织内,β-cadherin与E-catenin的表达呈负相关,且与乳腺癌的淋巴结转移潜能相关。本研究结果提示盐霉素作为TGF-β1的有效抑制剂对乳腺癌的侵袭、转移存在抑制作用。