随着人群结构的变化和抗生素的滥用、新发病原体的出现以及耐药细菌的增加,感染性疾病对人类健康的影响日益扩大。根据2019年WHO公布的全球十大健康威胁中,和感染密切相关的疾病占据了60%,包括流感、细菌耐药、埃博拉病毒、登革热、HIV等。然而目前在病原微生物检测领域中仍存在众多无法被准确诊断的危重感染,例如:15%-25%肺炎病例的病因不明确,20%的临床发热病例的病原因不明确。在复杂微生物感染检测方面,以全血和脑脊液样本为例,传统方法对血培养样本的阳性检出率为8-12%,脑脊液样本的阳性率检出率仅为8-10%。传统病原微生物检查包括形态学和血清学两方面,这些检测技术在病原微生物检测领域发挥了重要作用,但同时也存在一些不足,如病原体分离难度大、培养周期长、区分度不高、检测对象仅局限于特定已知的病原体,不能发现新的病原微生物等。而基于病原微生物核酸序列分析的宏基因组测序(Metagenomics Next generation Sequencing,mNGS)不仅可以极大简化检测流程,缩短检测时间,尤其针对传统方法难以鉴定的或新型病原体检测方面具有重大的意义。本研究通过DNA纳米球测序技术建立一套基于国产MGISEQ-2000测序平台的mNGS病原微生物检测流程,通过实验设计完善了样本预处理、DNA提取、文库构建环节的关键技术难点:1)使用0.5mm玻璃珠破壁结合超声打断将部分真菌检测灵敏度提高了10倍;2)使用10μm滤膜结合DNase降低人源背景核酸,提高2倍微生物序列检出;3)调整dNTP和接头使用量提高微起始量样本的一次检测成功率;4)提高测序数据量有助于发现微量病原体,提高检测灵敏度。最后分别采用细菌、真菌标准菌株和病毒阳性血清对照品进行流程灵敏度、重复性和特异性进行验证,并与临床结果比较验证该检测流程的检测准确性。