[背景与目的]:巨噬细胞源性泡沫细胞的形成是引起动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)发生发展的重要原因之一。因此,抑制泡沫细胞的形成是防治As的重要策略。三磷酸腺苷结合盒式转运蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)和三磷酸腺苷结合盒式转运蛋白G1(ATP-binding cassette transporter G1,ABCG1)都是一类整合膜蛋白,它们以ATP为能源促进细胞内游离胆固醇和磷脂的流出到细胞表面乏脂的载脂蛋白A-Ⅰ(apolipoprotein,apo A-I)或新生的高密度脂蛋白(nascent high-density lipoprotein,n HDL),并转运至肝脏进行代谢,抑制巨噬细胞内胆固醇大量蓄积,导致巨噬细胞泡沫化,进而抗As的作用。因此,挖掘调控ABCA1和ABCG1的表达机制,促进细胞胆固醇流出,对于As防治具有重要的意义。热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)是一组高度保守的伴侣蛋白。它可以调节多种蛋白质的活性和功能,具有维护细胞内环境稳定,提高细胞对应激原的耐受性,增加协同免疫等功能作用。此外,HSPs在细胞凋亡和炎症反应中也扮演着重要作用。近几年研究显示,心血管疾病患者的血浆中热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)水平明显的高于正常人,提示HSP70可能与心血管疾病的发生发展密切相关。相关研究报道,HSP70可以通过巨噬细胞表面Toll样受体,活化核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)细胞信号通路,激活细胞间粘附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1)、E-选择素(E-selectin)、血管细胞粘附分子1(vascular cell adhesionmolecule-1,VCAM-1)及白介素6(interleukin,IL-6)等黏附分子和细胞因子的表达,激活炎症细胞,引发炎性反应,促进As的发生发展。但是,HSP70是否能够通过胆固醇逆向转运影响As及其潜在机制仍不清楚。因此,本研究的目的是从脂质代谢的角度,探究HSP70对胆固醇逆向转运与As的影响及其潜在机制。该研究有助于明确以HSP70为代表的热休克蛋白在调节RCT和As中的作用,为开发防治As的药物提供了理论依据和新的靶点。[方法]:采用病毒转染过表达HSP70,并通过Western Blot检测转染效率,进行以下实验。首先,采用高效液相色谱仪和细胞油红O染色,检测HSP70过表达后巨噬细胞内脂质含量情况;运用q PCR和Western Blot,检测过表达HSP70后对胆固醇转运蛋白ABCA1和ABCG1表达的影响;通过液体闪烁计数仪,检测HSP70对胆固醇流出的影响;采用荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀分别检测HSP70对转录因子Elk-1与ABCA1和ABCG1启动子的结合情况;Elk-1过表达后和JNK激活剂茴香霉素处理后,通过q PCR或Western Blot分别检测JNK和Elk-1的磷酸化水平与ABCA1和ABCG1的表达情况,验证HSP70是否通过JNK/Elk-1信号通路影响ABCA1和ABCG1的表达。最后,在apo E-/-小鼠体内过表达HSP70,使用[3H]标记的胆固醇检测HSP70对小鼠RCT的影响;采用油红O、HE和Masson染色评估小鼠动脉粥样斑块的形成情况;收集小鼠的主动脉,采用q PCR和Western Blot以及免疫荧光等方法,检测小鼠主动脉和动脉粥样斑块中ABCA1和ABCG1表达水平。[结果]:Western Blot检测结果显示病毒转染后HSP70蛋白表达显著性增加,说明了细胞内过表达HSP70的模型构建成功。通过油红O染色和高效液相色谱仪检测表明,过表达HSP70能够增加巨噬细胞内总胆固醇、胆固醇酯、游离胆固醇的含量;进而检测HSP70过表达后ABCA1和ABCG1表达水平以及细胞胆固醇流出情况,结果显示过表达HSP70明显降低了ABCA1和ABCG1蛋白质和m RNA的水平,减少ABCA1和ABCG1介导的胆固醇流出。进一步探究HSP70调控ABCA1和ABCG1表达的机制。荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀的结果显示,HSP70降低了ABCA1和ABCG1启动子的活性,以及抑制Elk-1与ABCA1和ABCG1启动子区域的结合;q PCR和Western Blot检测显示,过表达HSP70显著性的抑制了Elk-1的活性,但是Elk-1过表达后,能够逆转过HSP70对ABCA1和ABCG1的抑制作用,说明了Elk-1是HSP70调控ABCA1和ABCG1表达的关键因子;Elk-1位于MAPKs信号通路上,其中JNK是Elk-1的上游,进一步检测HSP70对JNK的影响,结果表明过表达HSP70阻止了JNK的激活,并且JNK激活剂茴香霉素处理后,能够恢复Elk-1的活性与ABCA1和ABCA1的表达,证明了HSP70抑制ABCA1和ABCG1的表达通过JNK/Elk-1信号途径;通过检测小鼠血浆、肝脏和粪便中[3H]的含量,显示HSP70能够降低小鼠体内的RCT效率;小鼠心脏的主动脉瓣的冰冻切片染色显示,HSP70能够显著的促进动脉粥样斑块的形成;检测小鼠主动脉和斑块内的ABCA1和ABCG1的表达情况,表明过表达HSP70能够下调ABCA1和ABCG1的表达。[结论]:1.HSP70通过抑制JNK磷酸化,阻止Elk-1与ABCA1和ABCG1启动子区域的结合,下调ABCA1和ABCG1的表达,降低其介导的胆固醇流出,促进细胞内脂质蓄积。2.HSP70通过抑制ABCA1和ABCG1的表达,减少HDL水平,降低胆固醇逆向转运,促进动脉粥样硬化的发生发展