【摘 要】
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目的:探究乙酰化修饰对天然免疫toll like receptor 9（TLR9）信号通路的调节机制,评估TLR9乙酰化修饰与脓毒血症进展之间的关系,阐明TLR9乙酰化修饰影响脓毒血症的作用机制,为脓毒血症的诊断和防治提供一个新的靶点。方法:（1）用乙酰化抗体结合质谱确定TLR9乙酰化修饰位点:在小鼠单核巨噬细胞Raw264.7中,用免疫沉淀（immunoprecipitation,IP）结合免疫
【基金项目】
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2018年国家自然科学基金（81760513）:肿瘤源性免疫球蛋白G调控天然免疫Tol样受体信号通路在宫颈癌转移中的作用及机制研究； 右江民族医学院2016年度校级科研项目（博士引进科研启动课题）（yy2016bsky02）:肿瘤源性免疫球蛋白G调控TLR4信号通路在肿瘤侵袭转移中的作用机制研究；
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目的:探究乙酰化修饰对天然免疫toll like receptor 9（TLR9）信号通路的调节机制,评估TLR9乙酰化修饰与脓毒血症进展之间的关系,阐明TLR9乙酰化修饰影响脓毒血症的作用机制,为脓毒血症的诊断和防治提供一个新的靶点。方法:（1）用乙酰化抗体结合质谱确定TLR9乙酰化修饰位点:在小鼠单核巨噬细胞Raw264.7中,用免疫沉淀（immunoprecipitation,IP）结合免疫印迹（western blot,WB）技术证明TLR9发生乙酰化修饰。在人胚肾细胞293T中,将HA-TLR9质粒与乙酰化转移酶HA-CBP质粒共转染,用IP结合WB（应用泛乙酰化抗体）技术验证TLR9乙酰化修饰,并用质谱鉴定TLR9的乙酰化修饰位点;（2）在Raw264.7细胞中下调CBP表达后用TLR9配体ODN处理与不处理,再用免疫荧光（immunofluorescence,IF）技术检测TLR9乙酰化修饰对转录因子NF-κB进入细胞核的影响;（3）在293T细胞中过表达TLR9和TIRAP,分别加去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（trichostatin A,TSA）、尼克酰胺（又名烟酰胺,niconictinamide,NAM）刺激细胞,经免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,Co IP）后做WB分析两者的相互作用;（4）在293T细胞中过表达TLR9和CBP后分别用ODN处理与不处理,应用报告基因技术检测NF-κB的反应元件活性,用酶联免疫吸附测定技术（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）和实时荧光定量PCR（RT-q PCR）检测炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的产生;（5）用ODN处理BALB/c小鼠构建脓毒血症模型,应用免疫组化技术（immunocytochemistry,IHC）检测以上小鼠肺组织TLR9乙酰化及炎症因子水平,并进行分析比较。结果:（1）质谱鉴定结果表明TLR9分子上存在7个赖氨酸（Lysine,K）乙酰化位点;（2）ODN刺激可促进CBP出核并与TLR9相互作用;（3）下调CBP表达后,TLR9乙酰化水平显著降低;（4）CBP介导TLR9发生乙酰化修饰;（5）ODN诱导CBP和TLR9发生相互作用;（6）TSA或NAM促进TLR9和TIRAP发生相互作用;（7）下调CBP表达后,ODN诱导NF-κB进入细胞核减少;（8）过表达CBP增强NF-κB反应元件活性;（9）过表达CBP增加TLR9信号通路终产物TNF-α、IL-6、IL-1β的产生;（10）动物实验证实TLR9乙酰化修饰增加炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的产生。结论:（1）ODN诱导CBP出细胞核与TLR9发生相互作用,并介导TLR9在第348、361、381、472、475、489及657位K发生乙酰化修饰;（2）乙酰化修饰增强TLR9信号通路,增加炎症因子的产生,促进脓毒血症的进展。
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