溶菌酶,又称N-乙酰胞壁质聚糖水解酶,是一种能水解微生物细胞壁黏多糖的碱性水解酶,其广泛分布于不同生物体中。溶菌酶作为天然的蛋白质,对动物无害,无毒,不会残留在体内。海参i-型溶菌酶基因由本实验室于2007年首次分离和鉴定,并已将其目的蛋白分别在原核细胞和真核细胞中高效表达。本课题以实验室已经构建并表达的海参i-型溶菌酶蛋白的毕赤酵母基因工程菌HS3-1为发酵出发菌株。首先采用5 L发酵罐对基因工程菌HS3-1进行发酵小试,种子培养阶段使用YPD和BMGY培养基,BSM为发酵罐培养基。发酵罐各参数设定为温度30℃,pH 6.0,搅拌速度500 rpm/min,溶氧30%。种子液在发酵罐培养过程中,当BSM培养基中甘油耗尽后进入甘油补料阶段,其补料的速度为18.15 mL/h/L,时间为5 h。当菌体湿重达到180-220 g/L时,酵母细胞饥饿1 h。最后进行甲醇诱导阶段,利用甲醇检测器实时监测发酵液中甲醇浓度,并将其控制在1%（V/V）,诱导时间为96 h。分析得到发酵液酶产量为58 mg/L,经过镍离子亲和层析后得到海参溶菌酶精制产品,其酶活力为1238 U/mg。在5 L发酵罐的基础上,进一步利用30 L发酵罐进行毕赤酵母基因工程菌株HS3-1的放大生产,30 L发酵罐相比于5 L发酵罐有较好的稳定性。利用高效液相色谱对纯化后的精制产品进行鉴定,本实验获得的精制产品与标准品出峰时间相同,即初步确认该产品为海参i-型溶菌酶。进一步质谱分析结果显示,该产品的分子量大小约为14.7 kDa,与海参i-型溶菌酶的理论计算分子量基本相符。对所获得的海参i-型溶菌酶的酶学性质分析表明,该i-型溶菌酶的反应条件为:最适温度35℃,在25-65℃有较好的热稳定性,最适pH 6.5,在pH 5-8.5范围内较稳定。Na⁺对酶活有促进作用,K⁺、Ca²⁺和Al³⁺对酶活影响不大,Co²⁺、Mg²⁺和Mn²⁺三种金属离子则对酶活有抑制作用。酶反应动力学研究得到米氏方程,计算出最大反应速度V_max=207.47μg/mL*min,米氏常数K_m=0.667μg/mL。通过本课题的研究,初步完成利用毕赤酵母基因工程菌发酵生产海参i-型溶菌酶的逐级放大及分离纯化的研究,并对产品纯度及海参i-型溶菌酶分子量大小进行分析,确定海参i-型溶菌酶的最佳反应条件,为该溶菌酶的应用奠定了基础。