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第一部分:p38MAPK介导细胞内钙超载与凋亡参与原代大鼠心肌细胞氧糖剥夺-复氧损伤目的 探讨原代大鼠心肌细胞氧糖剥夺-复氧损伤中p38MAPK与钙超载及凋亡的关系方法 取出生1～3d的SD大鼠,分离培养心肌细胞,采用随机数字表法分为3组:对照组(C组)、氧糖剥夺-复氧组(OGD/R组)、SB203580预处理组(OGD/R+SB组)。OGD/R组采用缺氧小室对细胞进行氧糖剥夺6h复氧2h。OGD/R+SB组氧糖剥夺前采用10μmol/L的p38MAPK抑制剂SB203580孵育1h。倒置显微镜下观察心肌细胞形态,采用CCK-8法检测细胞活力,2,4-二硝基苯肼显色法测定培养基上清液乳酸脱氢酶释放率,流式细胞术测定细胞内钙离子浓度,TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡率,western blot法检测心肌细胞内p-p38MAPK,p-STAT3、SERCA2以及Cleaved-caspase 3蛋白表达,荧光定量PCR法检测细胞内IL-6、IL-1β、SERCA2 mRNA表达。结果 与C组比较,OGD/R组心肌细胞胞质回缩、细胞膜折光率降低、细胞坏死,细胞活力明显降低(P<0.01),LDH释放明显增多(P<0.01),细胞内钙离子浓度显著升高(P<0.01),细胞凋亡率明显增多(P<0.01);p-p38MAPK 和 Cleaved-caspase3 蛋白表达升高(P<0.01),p-STAT3、SERCA2蛋白表达减少(P<0.01),细胞内炎症因子IL-6和IL-1β mRNA的表达水平升高(P<0.01)。与OGD/R组比较,OGD/R+SB组心肌细胞形态接近正常且数量增多,细胞活力明显升高(P<0.01),LDH释放率明显降低(P<0.01),细胞内钙离子浓度显著减少(P<0.01),细胞凋亡率明显降低(P<0.05);p-p38MAPK、Cleaved-caspase3 蛋白表达降低(P<0.05),p-STAT3、SERCA2 蛋白表达升高(P<0.05),细胞内炎症因子IL-6和IL-1β mRNA降低(P<0.01)。结论 p38MAPK介导细胞钙超载与凋亡参与原代大鼠心肌细胞OGD/R损伤,其机制可能与下调SERCA2和p-STAT3有关。第二部分:Hsp70通过调控p38MAPK信号介导细胞内钙超载与凋亡参与原代大鼠心肌细胞氧糖剥夺-复氧损伤目的 通过基因沉默Hsp70的表达,进一步探讨Hsp70通过调控p38MAPK信号介导细胞内钙超载与凋亡参与原代大鼠心肌细胞OGD/R损伤方法 取出生1～3d的SD大鼠,分离培养心肌细胞,采用随机数字表法分为4组:阴性对照组(NC组)、氧糖剥夺-复氧组(NC+OGD/R组)、Hsp70基因沉默组(Hsp70shRNA+OGD/R 组)、Hsp70 基因沉默加 p38MAPK 抑制剂组(Hsp70shRNA+ODG/R+SB组)。复氧2h时,采用CCK-8法检测细胞活力,2,4-二硝基苯肼显色法测定培养基上清液LDH释放率,流式细胞术测定细胞内钙离子浓度,TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡率,western blot法检测心肌细胞内Hsp70、p-p38MAPK、p-STAT3、SERCA2 以及 Cleaved-caspase 3 表达水平。结果 与NC+OGD/R组比较,Hsp70shRNA+OGD/R组心肌细胞活力明显降低(P<0.01),LDH释放率明显升高(P<0.01),和细胞内钙离子浓度明显升高(P<0.01),细胞凋亡率明显增加(P<0.05);p-p38MAPK、Cleaved-caspase3蛋白表达显著升高(P<0.01);Hsp70、SERCA2 以及 p-STAT3 蛋白表达明显减少(P<0.05)。与 Hsp70shRNA+OGD/R组比较,Hsp70shRNA+ODG/R+SB组心肌细胞活力明显升高(P<0.01),LDH释放率明显降低(P<0.01),细胞内钙离子浓度明显降低(P<0.01),细胞凋亡率明显减少(P<0.01);p-p38MAPK、Cleaved-caspase3 蛋白表达显著降低(P<0.05),SERCA2 以及 p-STAT3蛋白表达明显增加(P<0.01)。结论 Hsp70通过调控p38MAPK参与原代大鼠心肌细胞OGD/R损伤后细胞内钙超载与凋亡。