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目的(1)构建稳定表达HBx的转基因细胞模型L02/HBx,为研究HBx致肝细胞恶性转化和癌变机制奠定基础。(2)观察L02/HBx细胞的形态学改变及细胞增殖、凋亡及细胞周期的变化,研究HBx对L02肝细胞生物学特性的影响,以期进一步揭示乙肝相关性肝细胞癌的发生机制。(3)观察阿霉素(ADM)干预后L02/HBx的生长趋势以及凋亡与细胞周期的改变情况,以求在探索HBx新的致癌机制上取得新的突破,也希望能为肝细胞癌在化疗领域提供有价值的理论依据。方法(1)通过G418剂量-反应分析实验,确定G418筛选L02细胞的最低致死浓度。(2)通过脂质体转染将HBx基因导入L02肝细胞,采用G418最低致死浓度筛选2周获取阳性克隆,扩大培养后分别运用RT-PCR和western blot检测HBx mRNA和HBx蛋白的表达情况,以确认稳定表达HBx的细胞模型L02/HBx构建成功。(3)培养L02/HBx细胞,并以L02/pcDNA3.1和L02细胞作为对照,采用倒置相差显微镜观察L02/HBx的形态学特点,运用MTT法检测并观察各组细胞的增殖情况,同时运用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡与细胞周期,对比观察各组细胞的凋亡和细胞周期的异同。(4)运用ADM培养L02/HBx、L02/pcDNA3.1和L02细胞后用MTT法分别检测ADM对各组细胞的生长抑制情况,并采用流式细胞仪检测ADM干预后各组细胞凋亡和细胞周期的变化。结果(1)G418剂量-反应分析试验结果显示,浓度为500-1000 mg/L的G418将培养的细胞全部杀死,而400 mg/L以下均有细胞存活,故500 mg/L为G418筛选L02细胞的最低致死浓度。(2)500 mg/L的G418筛选转染HBx的L02细胞2周后,可见阳性克隆的形成,扩增后RT-PCR和western blot检测均分别有HBx mRNA和HBx蛋白的表达。(3)倒置相差显微镜观察可见细胞成团、叠层生长,呈不规则状、体积变大、表面模糊、边界不清。MTT法检测结果表明L02/HBx生长速度加快,倍增时间为24h,而对照组细胞的倍增时间为48h。流式细胞仪检测结果显示,与对照组细胞相比,L02/HBx凋亡率低(0.09±0.13% vs 3.74±1.29%,p<0.05),G1期细胞比例降低(61.35±0.82% vs 67.80±6.84%,p<0.05),S期细胞所占比例增高(36.59±2.54% vs 22.37±2.17%,p<0.05),二倍体细胞比例降低(87.54±0.82% vs 97 94±1.77%, p<0.05),非整倍体细胞比例增高(12.46±0.82% vs 2.06±1.77%,p<0.05)。(4)经ADM干预后,MTT结果示L02/HBx凋亡速度加快.流式细胞仪检测发现,L02/HBx细胞的凋亡率大大增加(34.91±5.85% vs 0.09±0.13%,p<0.05),G1期细胞的比例仍比对照组低(82.81±6.48% vs 87.19±1.92%,p<0.05),S期细胞的比例亦比对照组高(13.84±6.16% vs 2.22±1.26%,p<0.05),二倍体细胞的比例显著降低( 75.33±9.47% vs 89.42±5.16% ),非整倍体细胞的比例明显增加(24.67±9.47%vs10.58±5.16%)。结论(1)稳定表达HBx的转基因细胞株L02/HBx构建成功,为我们研究HBx的致癌机制提供一个实验模型。(2) HBx能促进细胞周期进程,加快细胞的生长并抑制细胞的凋亡进而可能引起细胞增殖失控导致的恶性转化,在凋亡因子的作用下,HBx抑制损伤DNA的修复而促进细胞凋亡,并可能参与细胞的变异而导致恶变。同时也表明,HBx发挥生物学效应与其所处环境有关。