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恶性肿瘤是当前威胁人类健康的主要疾病之一。血管生成提供肿瘤生长、转移所需的营养以及代谢废物,所以阻断或抑制新生血管的生成是治疗肿瘤的有效策略。血管生成抑制剂与常规的肿瘤治疗药物相比,具有高效、低毒以及不易产生耐药性的特点。在目前发现的血管抑制剂中,Kringle5(K5)生物抑制活性最高,分子量小、穿透力强,是一种更有前途的血管抑制剂。同时,K5对于其它与血管生成有关的疾病的治疗,如糖尿病、镰状细胞视网膜病、类风湿性关节炎等,也有重要的应用值价。因此,将K5开发成为治疗肿瘤、视网膜充血等与新生血管生成相关疾病的药品,将具有广阔的市场前景。本实验在前期成功克隆和表达可溶型非融合血管生成抑制剂K5的基础上,诱导表达含有目标蛋白的菌体,确定目标蛋白存在于菌体破碎上清中,然后建立两步色谱法分离纯化K5。在对K5蛋白质进行分离纯化时,首先用SP Sepharose Fast Flow强阳离子交换色谱柱对含有目标蛋白质的菌体破碎上清进行初步分离,再用Sephacryl S-100HR凝胶排阻色谱柱对其进一步纯化。SP Sepharose Fast Flow色谱柱的分离条件为：洗脱液A液为50mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液,洗脱液B液为0.5mol/L NaCl的A液,缓冲液pH为5.2,洗脱速度为1.0mL/min,梯度程度长度为20min。Sephacryl S-100HR色谱柱的分离条件为：洗脱液为5mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0),洗脱速度为1.0mL/min。分离纯化得到的K5经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和高效凝胶排阻色谱(Shim-pack Diol300)检测到其纯度大于98%,达到了分离的效果。通过鸡胚尿囊膜法确定纯化的K5蛋白质具有抑制内皮毛细血管生长的活性。用差示扫描量热法,将纯化的K5溶液冻干时分别加入等量的保护剂：海藻糖、右旋糖苷40、海藻糖与右旋糖苷40的质量比为1：1、海藻糖与右旋糖苷40的质量比为2：1以及海藻糖与右旋糖苷40的质量比为1：2,实验结果表明K5的变性温度介于70～80℃之间,加保护剂海藻糖与右旋糖苷40的质量比为1：2时,K5的变性温度最高(即78.974℃),蛋白质最稳定。用F410试剂盒检测到大肠杆菌宿主蛋白质的含量占纯化后蛋白质含量的0.0359%,残余宿主菌菌体蛋白含量符合国家蛋白制品的相关规定。本研究为K5进一步的医药研究奠定了重要的基础。