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研究背景和目的蛋白质相互作用对肿瘤细胞的生物学行为过程具有非常重要的作用。PFKFB3是调节细胞糖酵解过程的一个关键酶,已经成为靶向肿瘤能量代谢研究的一个重要靶点。CDK4是调节细胞周期和增殖的一个关键蛋白,靶向CDK4抑制剂Palbociclib可以阻止细胞周期由G1→S期过渡,抑制多种乳腺癌细胞系的增殖,尤其是ER+乳腺癌细胞。此外,Palbociclib与来曲唑或者Fulvestrant（雌激素拮抗剂）的联合应用治疗乳腺癌明显优于来曲唑或者Fulvestrant单独用药,可明显改善乳腺癌患者预后。因此,Palbociclib于2015年被FDA审批通过。影响Palbociclib敏感性的机制有很多,比如p16缺失、pRb功能及CDK4表达水平。本课题通过一系列体外实验,研究CDK4与PFKFB3蛋白间存在相互作用并且影响Palbociclib敏感性的分子机制。方法构建HA-PFKFB3质粒,用HA标签的琼脂糖珠富集PFKFB3蛋白,采用质谱分析方法筛选与PFKFB3可能相互作用的蛋白;通过蛋白质免疫共沉淀技术（Co-Immunoprecipitation,CO-IP）和GST-Pulldown实验进一步验证CDK4与PFKFB3是否存在直接相互作用;根据PFKFB3功能域,将PFKFB3进行分段,研究CDK4与PFKFB3的结合片段;根据PFKFB3生物信息学分析,找到人、老鼠、斑马鱼、蟾蜍和叶吻银鲛中的同源氨基酸,构建11个PFKFB3突变体,确定CDK4与PFKFB3的结合位点;此外,在Hela细胞中过表达不同标签的CDK4与PFKFB3质粒,用免疫荧光共聚焦显微镜观察PFKFB3与CDK4的细胞亚定位情况。将靶向CDK4小干扰RNA（siRNA-CDK4）和阴性对照干扰片段（siRNA-control）成功转染A549细胞后,利用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹技术分别检测CDK4在mRNA和蛋白水平的变化;蛋白质免疫印迹法检测细胞中PFKFB3蛋白水平变化;18F-FDG摄取实验、乳酸检测试剂盒及海马技术检测细胞中葡萄糖、乳酸的量及氧耗的变化;细胞计数法和软琼脂糖克隆形成实验检测细胞增殖的变化和克隆形成能力;FCM法检测细胞周期。通过免疫组化实验检测PFKFB3蛋白和CDK4蛋白在乳腺癌组织中的表达水平,并且对PFKFB3和CDK4两种蛋白表达水平在乳腺癌组织的相关性进行统计分析;通过泛素化修饰、蛋白酶体和放线菌酮实验明确PFKFB3蛋白变化对CDK4蛋白稳定性的影响;构建稳定敲除PFKFB3基因的MCF-7细胞株,CD-DST实验及CCK-8实验检测PFKFB3基因对Palbociclib在MCF-7细胞中的敏感性影响。结果PFKFB3质谱结果分析,CDK4可能与PFKFB3存在相互作用。CO-IP和GST-Pulldown技术验证PFKFB3与CDK4间存在直接相互作用,并且证明K147位点是PFKFB3与CDK4结合的关键位点。免疫荧光共聚焦实验技术检测到PFKFB3与CDK4共定位于Hela细胞的细胞核中。将靶向CDK4小干扰RNA（siRNA-CDK4）转染A549细胞,可明显抑制CDK4的mRNA和蛋白表达（P<0.01）。CDK4蛋白抑制后,PFKFB3蛋白表达水平明显下降;A549细胞中18F-FDG摄取量下降（42.21±1.90）%（P<0.05）,乳酸的生成量减少（29.39±5.35）%（P<0.05）,而细胞的基础耗氧量增加（67.17±3.58）%（P<0.01）;A549细胞的细胞数在48、72和96 h均明显降低（P<0.05）,克隆形成能力下降（P<0.05）;FCM法检测A549细胞中G1期细胞比例明显增多（P<0.05）,S期细胞比例明显减少（P<0.05）。免疫组化结果检测PFKFB3蛋白和CDK4蛋白在乳腺癌组织中高表达（P值均<0.001）,且呈正相关。MCF-7细胞中,过表达HA-PFKFB3后,发现CDK4蛋白表达水平增加;用小干扰RNA技术瞬时敲除PFKFB3后,发现CDK4蛋白表达水平下降,而CDK4 mRNA水平没有变化。MCF-7细胞和293T细胞中,发现敲除PFKFB3后,CDK4的泛素化水平显著升高,蛋白水平显著下降,而加入蛋白酶体抑制剂（MG132）后,CDK4蛋白水平没有下降。MCF-7细胞中,加入放线菌酮（CHX）分别处理0 h、1 h和3 h后,发现过表达PFKFB3组,CDK4蛋白的降解速率显著低于对照组。CD-DST实验结果显示,分别加入1μM、5μM、10μM、15μM和20μM Palbociclib（CDK4抑制剂）处理MCF-7细胞24h后,随着药物浓度增加,MCF-7细胞存活率分别是81.56%、51%、27.83%、2.38%和0.69%。相同浓度梯度的Palbociclib分别处理稳定敲除PFKFB3的MCF-7细胞和对照组细胞后,稳定敲除PFKFB3的MCF-7细胞组对于Palbociclib的敏感性下降。结论PFKFB3通过与CDK4直接相互作用,抑制CDK4泛素-蛋白酶体途径降解,增加CDK4蛋白稳定性,进而使Palbociclib对MCF-7细胞的敏感性增加。