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目的:P53蛋白作为一种多功能转录因子,在DNA修复、细胞增殖、衰老、凋亡、代谢和细胞分化等过程中发挥着重要的调节作用。它也是目前研究发现最关键的一种肿瘤抑制因子,人类肿瘤的发生都与p53基因突变、缺失或p53信号通路障碍有关。最近十年,p53蛋白在肿瘤的诊断和治疗中的作用已经得到肯定,因此,利用毕赤酵母表达系统实现p53蛋白的工业化生产具有显著的应用价值。 方法和结果:通过PCR扩增获得p53-His-tag基因片段,克隆到表达载体pPIC3.5K,经多种酶切和测序验证表明pPIC3.5K-p53-His-tag构建成功。以线性化的p53表达质粒电转化营养缺陷型毕赤酵母KM71,首先在不含组氨酸的MD培养基上筛选营养互补的克隆子,PCR检测p53基因的存在,继而用不同浓度的G418抗性培养基筛选出高拷贝的转基因阳性克隆子。然后,阳性克隆以小规模摇瓶发酵,先用甘油培养基(BMGY)扩增菌体,接着用甲醇培养基(BMMY)诱导,免疫荧光染色(IF)和Western Blotting(WB)检测结果证实了p53蛋白的表达。探索发酵时间、pH和甲醇浓度的影响,结果表明发酵72h、pH7.0、甲醇浓度1%时p53蛋白表达量最高。通过镍柱亲和层析纯化p53蛋白,结果显示在咪唑浓度200-300?M时p53蛋白的洗脱效果最佳,并通过超滤获得了较高浓度的蛋白质。将p53蛋白以低渗透析的方法包被到红细胞血影, IF和WB结果表明p53蛋白可成功装载至血影;将其与HeLa肿瘤细胞共培养,CCK8实验结果表明HeLa细胞的生长受到显著抑制;细胞活性/细胞毒性试剂盒的检测结果显示HeLa细胞在重组p53蛋白作用下出现了较严重的死亡现象。 结论:本课题实现了人源p53蛋白在毕赤酵母表达系统中的表达,重组p53蛋白对HeLa癌细胞的生长有抑制作用。本研究为将来大规模生产具有良好生物学活性的人源p53蛋白奠定了基础。