急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)是造血干细胞的恶性克隆性疾病，其克隆中的白血病细胞增殖失控、分化障碍、凋亡受阻，而停滞在细胞发育的不同阶段。NB4细胞为APL细胞株，具有急性早幼粒细胞白血病的形态学特征和生物学特性。 抑癌基因P27kipl作为细胞周期的负调控因子，是一种多功CDKI(cyclin dependent kinase inhibitor)，可通过与cyclinE-CDK2复合物结合而抑制其活性，阻止细胞进入S期，使细胞停滞于G1期。癌基因cyclinE作为细胞周期正调控因子，也被证实是细胞进入S期的关键性调节基因。 本实验研究了AS2O3和/或TGF-β1作用于NB4细胞后的细胞周期分布情况、凋亡情况、P27kipl、cyclinE、TGF-β1水平的变化，希望能为阐明白血病的发病机制及寻找更好的治疗策略和揭示临床预后提供一些线索。 实验方法： 1、MTT法检测As2O3对NB4细胞的细胞毒性及IC50。 将8×104/ml细胞0.1ml接种于96孔板。加入AS2O30.1ml，浓度分别为0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L、64μmol/L。放入培养箱中培养24h、48h、72h后取出，每孔加入20μl MTT继续培养4h、取出后离心1000rpm 10min，扣板，每孔再加入150μl DMSO震荡后酶标仪570nm检测各孔吸光度，以空白对照孔为零，绘制NB4细胞生长抑制曲线，取得IC50。抑制百分率=(实验孔吸收值/对照孔吸收值)×100。 2、AS2O3和/或TGF-β1处理NB4细胞 以含10％胎牛血清RPMI1640培养液，37℃、5％CO2条件下培养NB4细胞，取对数生长期的细胞，显微镜下计数，调整NB4细胞浓度为5×105/ml，以5μmol/L AS2O3 和/或5ng/ml TGF-βl处理，于不同时间搜集细胞。 3、台盼蓝拒染实验检测细胞生长抑制率 分别于培养的24、48、72小时搜集5μmol/L．As2O3 和/或5ng/ml TGF-βl处理的NB4细胞及对照组细胞，取一滴细胞悬液，加入两滴2％台盼蓝，2分钟后显微镜下记数活细胞百分率。 4、瑞氏-吉姆萨染色观察凋亡形态学的变化 取5μmol/L AS2O3和/或5ng/ml TGF-βl处理48小时的NB4细胞，用细胞涂片离心机制成涂片，加一滴瑞氏工作液染色1分钟，再加一滴吉姆萨工作液染色15分钟后流水冲洗自然风干，光镜下观察细胞的凋亡情况。 5、流式细胞术检测细胞周期和凋亡 将各种药物处理的不同作用时间的NB4细胞搜集至离心管中，1000r/min离心5分钟，洗涤两次，加入80％乙醇1ml，4℃冰箱中过夜。1000r/min离心5分钟，洗去固定液，加入PI染液，4℃避光染色30分钟后流式细胞仪(FACS Calibur，BD，美国，细胞周期分析软件为ModFit LT3.0)进行测试。记录激发波长488nm处的红色荧光。 6、半定量RT-PCR检测P27Kipl、cyclinE及内源性TGF-β1的mRNA水平 (1)细胞总RNA提取及半定量 收集细胞于灭菌的1.5ml 塑料离心管中，用Trizol法提取RNA。用DEPC处理高压消毒的双蒸水6-15ul溶解RNA沉淀。取1μl溶解的RNA加入79μl DEPC处理高压消毒的双蒸水中，测量260、280 OD值。紫外分光光度计定量，取2.0≥OD260／OD280≥1.8的RNA，将其浓度稀释为3μg/μl。 (2)RT-PCR逆转录体系为RNA 3μl、5×Buffer 4μl、dH2O 8μl、dNTP 2μ1、随机引物1.5μl、MLV 1μl、HPR-I 0.5μ1。扩增体系包括逆转录反应产物cDNA 3μl、10×PCR缓冲液2.5μl、dNTP 1.5μl、TaqDNA聚合酶0.2μ1、dH2O 15.8μl、上下游目的引物各1μl。以β-actin作为内部对照。按照程序进行逆转录及扩增后，将13μl扩增产物加入含0.5mg/L溴化乙锭(EB)的2％琼脂糖胶中跑电泳。紫外透射分析仪(UVP)观察分析结果。 7、统计学分析 所得结果采用SPSS11.5统计软件进行分析。 实验结果： 1、不同浓度As2O3和/或TGF-β1对NB4细胞生长的抑制作用 As2O3和/或TGF-β1均能明显抑制NB4细胞的生长，促进NB4细胞的凋亡。As2O3对NB4细胞的抑制及促凋亡作用呈剂量-时间依赖关系，24h时IC50约为12μmol/L，48h约为5μmol/L，72h约为3μmol/L。 2、NB4细胞凋亡情况及细胞周期分布的改变 随着As2O3浓度的增加可见NB4凋亡小体数量增加。单用TGF-β1(5ng/ml)也使NB4细胞产生凋亡，但细胞形态改变没有As2O3(5μmol/L)处理组明显。联合处理组的NB4细胞凋亡比例明显大于单用As2O3、TGF-β1处理组。As2O3和/或TGF-β1均可使NB4细胞出现细胞周期阻滞，5μmol/L As2O3使NB4细胞阻滞在G2/M期，5ng/ml TGF-β1使NB4细胞阻滞在G1期，联合处理组主要为S期阻滞。 3、As2O3和/或TGF-β1作用于NB4细胞后P27Kip1、cyclinE、内源性TGF-β1以及bcl-2 mRNA表达水平的改变 As2O3处理组随其药物浓度的增加，P27KIP1及内源性TGF-β1的mRNA表达上调而cyclinE、bcl-2的mRNA表达下调；TGF-β1单独处理NB4细胞后P27KIP1、cyclinE、bcl-2的mRNA表达改变与As2O3处理组一致；联合处理组结果显示TGF-β1可增强As2O3上述作用。外源性TGF-β1浓度<5ng/ml时，内源性TGF-β1的mRNA表达上调，外源性TGF-β1浓度为10ng/ml时，内源性TGF-β1的mRNA表达下调。 讨论： As2O3是中药砒霜的主要有效成分，70年代发现可有效治疗APL。国内陈元仲等[11]发现As203诱导白血病细胞凋亡过程中内源性TGF-β1表达上调并伴有bcl-2表达下调。TGF-β1作为已知的最强的血细胞增殖抑制因子，其主要通过引起细胞周期阻滞而导致细胞凋亡。 本实验结果显示，当As2O3药物浓度≥5μmol/L时，NB4细胞出现了明显的G2/M期细胞周期阻滞，其原因可能是As2O3作用于NB4细胞后，G2/M期细胞内的活性氧 水平超过了细胞可耐受的范围，细胞不能进行正常的有丝分裂而阻滞于G2/M期，并引发凋亡。TGF-β1也有促进NB4细胞凋亡的作用。且联合应用As2O3和TGF-β1诱导NB4细胞凋亡的作用强于As2O3单药应用，并出现S期细胞周期阻滞，可见外源性TGF-β1可加强As2O3诱导NB4细胞凋亡的作用。以上实验结果提示二者在诱导细胞凋亡机制中可能存在交叉通路。 本实验结果表明，As2O3和TGF-β1调节P27Kip1、cyclinE、bcl-2基因表达趋势的功能是一致的。As2O3可能通过上调TGF-β1促进NB4细胞的凋亡。P27Kip1是TGF-β1信号传导途径的下游分子，是细胞增殖的负调节因子。cyclinE是细胞周期中期的正调节因子，P27Kip1和cyclinE两者相互作用以维持G1/S限制点的正负调控物的稳态。TGF-β1可能直接抑制了cyclinE的表达，或者通过调高的P27Kip1,表达而抑制cyclinE的活性，从而导致细胞周期阻滞。 本研究结果还提示，当作用于NB4细胞的外源性TGF-β1浓度<5ng/ml时，NB4细胞产生的内源性TGF-β1的mRNA表达上调；当外源性TGF-β1浓度为10ng/ml时，NB4细胞产生的内源性TGF-βl的mRNA表达下调。可见作用于NB4细胞的外源性TGF-β1浓度过强时可能拮抗内源性TGF-β1的表达，或与受体靶点过饱和有关。因此对未来TGF-β1应用于临床治疗白血病可能具有指导意义。 结论： 1、As2O3及TGF-β1均可诱导NB4细胞凋亡及细胞周期分布异常。 2、As2O3及外源性TGF-β1可能通过上调TGF-β1增加细胞凋亡,TGF-β1可能直接抑制了cyclinE的表达，或者通过调高的P27Kip1表达而抑制cyclinE的活性，从而导致细胞周期阻滞。 3、高浓度的外源性TGF-β1可拮抗内源性TGF-β1表达，可能存在TGF-β1受体靶点过饱和现象 4、P27Kip1的基因表达升高时，与之拮抗的cyclinE的基因表达急剧下调，进一步证明P27Kip1、cyclinE可能是As2O3和TGF-β1引起NB4细胞周期阻滞的关键中间效应物。