【摘 要】
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植物中参与ETI(Effector-triggered Immunity)抗病途径的NB-LRR(Nucleotide Binding-Leucine Rich Repeats)蛋白既是植物染病时的关键正调控因子,其过度表达和激活又是植物健康生长时的绊脚石,因此这类蛋白在植物细胞内的表达水平必须受到严格调控,以保证植物在该抗病时抗病,在该生长时正常生长。泛素/26S蛋白酶体系统(Ubiquitin
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植物中参与ETI(Effector-triggered Immunity)抗病途径的NB-LRR(Nucleotide Binding-Leucine Rich Repeats)蛋白既是植物染病时的关键正调控因子,其过度表达和激活又是植物健康生长时的绊脚石,因此这类蛋白在植物细胞内的表达水平必须受到严格调控,以保证植物在该抗病时抗病,在该生长时正常生长。泛素/26S蛋白酶体系统(Ubiquitin-26S Proteasome System,UPS)作为真核生物蛋白质降解的普遍机制,不可避免地成为NB-LRR蛋白质稳态调节的机制之一。拟南芥中存在着大量的泛素化E3连接酶,它们通过特异性识别抗病相关蛋白并通过UPS途径降解这些蛋白而成为了平衡植物抗病与正常生长发育问题中的关键因子。遗憾的是,由于基因功能冗余,这些编码泛素化E3连接酶的基因很难通过正向遗传学手段被筛选鉴定,因此大多数E3编码基因的生物学功能仍然未知。本研究在实验室前期对预测的泛素化E3连接酶进行生物信息学分析的基础上,通过基因序列分析与蛋白质比对发现拟南芥基因AT2G37150编码的蛋白具有典型的RING型结构域,并且经“Arabidopsis e FP Browser”分析发现该基因能够被多种病原菌诱导表达,因此我们猜测该基因编码的蛋白可能属于E3连接酶RING型家族成员,也可能参与了植物抗病免疫调控。因此,本研究在拟南芥官网上购买了AT2G37150的T-DNA插入单突变体Salk_021643,并在生理生化水平上对其进行了抗病相关表征,初步确定了该基因编码的蛋白作为泛素化E3连接酶参与植物免疫的假设理论。随后,本研究通过转基因或者杂交等遗传手段构建了AT2G37150的相关突变体,并且也对这些突变体进行了抗病相关表征,进一步探索了该基因在抗病免疫途径中的作用机制。本研究获得的主要结果如下:(1)对AT2G37150进行生物信息学挖掘,发现其编码的蛋白具有保守的RING型结构域,可能属于泛素化E3连接酶家族,并且该基因能够被多种病原菌诱导表达,说明其参与了植物免疫反应。(2)大肠杆菌体内的泛素化实验表明AT2G37150编码的蛋白确实具有泛素化E3连接酶活性,并且具有RING型连接酶家族特有的显性负性(Dominant-Negative effect,DN)效应。(3)与Col_0相比,AT2G37150的T-DNA插入单突变体Salk_021643虽然在形态学上没有明显的异常表型,但鲜重、抗病基因表达水平、病原菌侵染测试都表明该突变体具有增强的免疫表型。(4)Salk_021643 snc1双突变体的抗病表征实验表明AT2G37150的功能缺失促进了SNC1的组成性激活,增强了植物免疫。(5)免疫印迹分析(Western blotting,WB)和带RPS2(Resistant to P.syringae 2)的体外泛素化实验均表明AT2G37150编码的蛋白可能是通过降解RPS2来参与植物免疫反应。本研究通过反向遗传学筛选出了1个参与植物抗病防御反应的泛素化E3连接酶,为完善拟南芥泛素化基因库提供了实验参考数据。同时,对该E3的生物学和生化功能研究表明其确实具有泛素化连接酶活性并通过促进抗病相关蛋白的降解来减弱植株的抗病能量消耗,为将来进一步研究该E3的作用机理以及为作物抗病与产量平衡的育种研究提供理论基础。
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