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背景支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病。大量研究表明,支气管哮喘与高凝状态密切相关,哮喘炎症与凝血功能紊乱相互作用,共同促进支气管哮喘发生发展。组织因子(tissue factor,TF)是外源性凝血途径的重要启动子,也是连接凝血与炎症网络系统的关键分子。TF除了其促凝活性,还可与相应配体结合,激活脉管系统中炎症信号转导通路。反过来,炎症因子可促进上皮细胞和单核细胞表达TF。研究表明,哮喘患者血浆TF含量和活性升高,加重哮喘病情,促进气道重塑。尽管如此,TF在支气管哮喘凝血与炎症过程中的作用机制仍需大量研究进行阐明。凝血酶敏感蛋白-1(thrombospondin-1,TSP-1)是血小板α颗粒中的糖基质蛋白。在炎症因子的诱导下,TSP-1可由巨噬细胞、单核细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞、上皮细胞等多种细胞分泌释放至血液循环,参与血小板黏附与聚集,在血栓性疾病中发挥重要作用。TSP-1可诱导巨噬细胞趋化至炎性部位,进一步促进炎症反应。研究表明,TSP-1在多种肺疾病如慢性阻塞性肺疾病、慢性肺心病中异常表达,但其在支气管哮喘中的研究较少。肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样因子2(tumor necrosis factorαinduced protein-8 like-2,TIPE2)是新近发现的免疫负性调节分子,主要表达在免疫细胞如淋巴细胞和巨噬细胞,其在调节免疫平衡和炎症反应方面发挥重要作用。研究表明,TIPE2在儿童哮喘患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中表达下降,在脐静脉内皮细胞中TIPE2可通过p38MAPK以及ERK1/2信号通路调节TF的表达。但在哮喘中TIPE2与凝血物质之间的关系尚未明确。本研究旨在探讨哮喘患者PBMCs中TIPE2、TF及血浆中TF、TSP-1的表达情况及TIPE2与凝血物质TF、TSP-1的相关性。此外,由于屋尘螨是最常见、危害最大的室内变应原,是哮喘在世界范围内的重要发病原因。且血源性TF主要来源于单核细胞,单核细胞来源的TF微粒活性最强。TIPE2、TF在一定条件下均可在单核细胞中表达。因此我们选取单核细胞系THP-1细胞作为载体,探讨屋尘螨提取液(house dust mite extract,HDME)刺激下THP-1细胞中TIPE2和TF的表达及相关机制。目的研究TIPE2与支气管哮喘患者凝血物质TF、TSP-1的相关性;并进一步探讨屋尘螨提取液刺激的THP-1细胞中TIPE2和TF的表达及相关信号通路变化,为支气管哮喘的诊断和治疗提供新思路。材料与方法1.收集2015年12月~2016年6月郑州大学第一附属医院门诊及住院确诊的支气管哮喘患者65例作为病例组,同时纳入同时期年龄、性别差异无统计学意义的健康体检者40例作为健康对照组。2.采用Western blot检测哮喘病例组和健康对照组PBMCs中TIPE2、TF蛋白表达水平。3.采用ELISA检测哮喘患者和健康者血浆中TF、TSP-1的表达水平。4.采用RT-PCR检测屋尘螨提取液刺激THP-1细胞后,THP-1细胞中TIPE2、TF mRNA的表达水平。5.采用western blot检测屋尘螨提取液刺激THP-1细胞后,p38MAPK、NF-κB信号通路蛋白的变化情况。结果第一部分支气管哮喘患者TIPE2与TF、TSP-1中的表达及相关性研究1.与健康对照相比,哮喘患者PBMCs中TIPE2蛋白表达水平降低(p<0.01),TF蛋白表达水平明显升高(p<0.01)。2.与健康对照相比,哮喘患者血浆中TF、TSP-1蛋白表达水平均明显升高(p<0.01)。3.支气管哮喘患者PBMCs中TIPE2蛋白表达水平与PBMCs和血浆中TF蛋白表达水平均呈负相关(r=-0.3828,p<0.01;r=-0.5422,p<0.01)。此外,PBMCs中TIPE2蛋白表达水平与患者血浆中TSP-1蛋白表达水平呈负相关(r=-0.3013,p<0.05)。第二部分屋尘螨提取液刺激THP-1细胞后TIPE2、TF的表达及p38MAPK/NF-κB信号通路变化研究1.不同浓度(0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml)屋尘螨提取液刺激THP-1细胞4h后,TIPE2 mRNA相对表达量降低,TF mRNA相对表达量升高(p<0.05),且在刺激浓度1μg/ml时变化最为明显(p<0.05)。选用1μg/ml屋尘螨提取液刺激THP-1细胞不同时间(1h,2h,4h,8h)后,TIPE2 mRNA相对表达水平下降(p<0.05),TF mRNA相对表达水平升高(p<0.05),且在刺激4h时最为显著(p<0.05)。2.1μg/ml屋尘螨提取液刺激THP-1不同时间后(0min,15min,30min,1h),p38MAPK、NF-κB蛋白磷酸化水平随着时间的增加表达逐渐增高,且在1h时升高最明显。结论1.哮喘患者PBMCs中TIPE2蛋白表达水平降低、TF蛋白表达水平升高,血浆中TF、TSP-1蛋白水平升高。哮喘患者PBMCs中TIPE2与凝血物质TF、TSP-1水平呈负相关。提示TIPE2可能通过与TF、TSP-1相互作用参与哮喘患者高凝状态。2.初步证实屋尘螨提取液可诱导THP-1中TIPE2 mRNA表达水平降低,TF mRNA表达水平升高,且可引起THP-1细胞中p38MAPK、NF-κB蛋白磷酸化信号增强。