1.研究背景腰椎管狭窄症(Lumbar spinal stonosis LSS)是指各种原因导致的椎管有效容积减少,压迫脊髓、神经根引起麻木、疼痛等神经症状的疾病。椎体后柱结构改变是导致椎管狭窄的主要原因之一。临床上最常见的椎管狭窄多是由椎管内黄韧带(Ligamentum Flavum LF)增生肥厚引起。增生且肥厚的黄韧带压迫硬膜囊、神经根,可以导致严重的神经麻木、疼痛症状,引起下肢运动功能的障碍。解剖学研究认为中央型椎管狭窄症的患者,其黄韧带厚度可达7至8mm,而正常人椎管内黄韧带厚度不超过4mm。弹性纤维丢失、组织纤维化,胶原组织增多是退变的黄韧带共同的病理特征。目前虽然对黄韧带增生肥厚的病理生理机制,已经进行了多发面的研究,初步阐述了黄韧带肥厚的发生、发展的相关问题,但其发病机制仍不清楚。包括机械应力和生长因子等许多因素参与了病变过程,一般认为机械应力的作用和生长因子的参与是造成黄韧带增生肥厚的主要因素。连续的机械应力会导致黄韧带变性。黄韧带的增生、肥厚是一种炎症反应,脊柱的不断活动引起黄韧带结构的轻微损伤,机体通过生成炎症瘢痕的来修复这些微小的损伤。损伤不断形成,不断被修复,最终导致黄韧带不断增厚。在这个过程中,多种生长因子参与了损伤修复过程,转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1 TGF-β1)作为一种促纤维化的细胞因子,在损伤修复的过程中,作用尤为明显。机械应力可以增加黄韧带细胞中TGF-β1的生成[12-13]；活化的TGF-β1可引起胶原蛋白、纤维连接蛋白和糖蛋白等细胞外基质(extracellular matrixc ECM)的产生。已经证实TGF-β1可以激活黄韧带细胞中胶原的表达。过度的表达TGF-β1可以增加细胞内胶原含量,引起黄韧带细胞纤维化,导致细胞肥厚、退变。在腰椎管狭窄中,肥厚的黄韧带组织大量表达TGF-β1。而通过对比正常黄韧带与增生肥厚黄韧带组织内TGF-β1含量发现,两组有显著差异。这说明TGF-β1大量表达与黄韧带退变相关。同样的情况在肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化和心肌肥厚等疾病中均有发生。因此,TGF-β1在腰椎管狭窄的发病机制中对黄韧带肥厚有重要作用。然而,TGF-β1引起黄韧带肥厚分子机制,特别是TGF-β1激活胶原表达的分子机制尚未完全阐明。TGF-β1可能在损伤、炎症及纤维化之间起到一定的连接作用。新近的研究认为结缔组织生长因子(connective tissue growth factor CTGF)参与了黄韧带肥厚的病理过程。CTGF参与创伤修复。当炎症刺激机体时,组织中CTGF表达增加,而CTGF编码的蛋白可诱导成纤维细胞增殖、分化,增加ECM合成和新生血管形成。通过对正常黄韧带组织与增生肥厚黄韧带组织细胞外基质中CTGF含量进行对比发现,两组有显著差异,其表达的增加与韧带肥厚程度成正相关,证明CTGF在肥厚腰椎黄韧带中过表达,与黄韧带肥厚的机制有关。TGF-β1能够活化CTGF的表达,发挥其生物学功能。譬如TGF-β1可诱导的CTGF mRNA在人皮肤成纤维细胞中的表达,同时TGF-β12必需在CTGF的作用下完成某些生物学功能,如促进细胞增殖,ECM合成等[22]。而在TGF-β1发挥功能的时候,加入CTGF中和抗体(NA CTGF),可以减弱TGF-β1促纤维化作用。由此我们认为：人类日常脊柱过度屈伸活动造成黄韧带微损伤后,产生瘢痕炎症反应,反应中黄韧带组织释放TGF-β1,介导调控CTGF表达修复损伤的黄韧带。当这种炎症反应过度时,可导致黄韧带增生肥厚。TGF-β1可通过调控CTGF高表达导致黄韧带肥厚增生,CTGF是TGF-β1促黄韧带肥厚增生的下游介质[24],阻断TGF-β1或TGF-β1诱导的CTGF表达均能够抑制肥厚增生。TGF-β1是一种具有多种功能的蛋白多肽,分布较为广泛,在多个器官细胞生长、分化、调零等过程发挥作用。同时在炎症过程中有重要作用,阻断TGF-β1可以导致炎症反应的加重。而CTGF的功能则相对局限,CTGF在损伤愈合中,发挥促瘢痕形成的功能。抑制黄韧带表达CTGF,则可导致韧带内微损伤愈合的减慢。由于TGF-β1和CTGF均有明显的促纤维化作用,在组织纤维化中往往同时出现高表达,而TGF-β1又有许多CTGF没有的功能,因此有学者认为CTGF作为TGF-β1致纤维化作用的下游效应分子,起到调节ECM表达的作用。如何在不改变TGF-β1和CTGF其它作用的前提下,通过选择性的抑制黄韧带中TGF-β1上调的CTGF表达,是目前抑制黄韧带肥厚研究中急需解决的问题。已知细胞信号传导通路在细胞生长因子的表达、调控中起着关键作用,信号通路的激活有否,决定生长因子的上调或下调,直接或是间接影响这些因子生物学功能的发挥。另外,某些因子必须在特异性的细胞信号介导下才能发挥功能。在腰椎黄韧带增厚的过程中,是否存在这样的特异性的信号传导通路,可以调控TGF-β1活化,特异性诱导CTGF产生,控制细胞增殖和纤维化。本研究正是基于这个出发点,希望揭示TGF-β1/CTGF促进黄韧带肥厚增生的作用机制,发现两者间特异性的信号传导通路,通过抑制传导通路的作用,抑制腰椎黄韧带中TGF-β1诱导的CTGF表达,减少细胞增殖及纤维化,为治疗腰椎黄韧带肥厚提供新的思路和方法。损伤愈合和瘢痕形成过程中,Smads信号通路和MAPKs通路作用最为显著。Smads是一种细胞内传导蛋白,可以在TGF-β1的作用下表达活化,而且Smads通路参与CTGF表达上调的过程,CTGF基因启动子中有Smads结合元件,如果这部分元件出现突变,那么CTGF的表达将受到抑制,TGF-β1诱导CTGF表达的作用也同样收到抑制。Smads通路是TGF-β1在细胞传导的主要通路,通过Smads通路,TGF-β1可以调控CTGF表达,但研究显示Smads通路不能上调所有组织细胞中CTGF的表达。而且Smads通路作用广泛,不具备特异性。MAPKs也是一条胞内信号传导通路,认为该通路主要与创伤的愈合相关,活性氧、机械创伤等可以刺激MAPKs通路的活化。目前,在哺乳动物细胞已鉴定了四条MAPKs信号传导通路：ERKl通路、ERK2通路、JNK通路、P38通路。近年来,不断有研究发现MAPKs通路也参与CTGF的表达调控。因此目前认为在TGF-β1对CTGF表达的调控作用是MAPKs通路和Smads通路共同参与的结果。而抑制MAPKs通路并不影响Smads通路的磷酸化,不会干扰Smads通路介导的各种生物学功能。目前无人研究黄韧带细胞中MAPKs通路的介导作用。TGF-β1是否通过特异性MAPKs通路调控黄韧带细胞中CTGF的表达,仍然不是很清楚。通过因此我们设想有特异性MAPKs通路参与了腰黄韧带肥厚增生过程中TGF-β1调节CTGF表达的过程,阻断通路能抑制腰黄韧带肥厚增生,这也是本研究的立论依据。2.研究目的本研究所需黄韧带均为腰椎骨折和腰椎盘突出症患者行后路减压手术时得到。研究通过对细胞活性的研究,探讨TGF-β1/CTGF在黄韧带细胞增殖,韧带肥厚中的重要作用；通过对CTGF及ECM主要成分Ⅰ型和Ⅲ型胶原在TGF-β1处理的黄韧带细胞中的表达,探讨MAKPs信号通路在TGF-β1/CTGF调控黄韧带肥厚退变机制中的重要性。本研究旨在在基因水平探索控制腰黄韧带肥厚增生的靶点,从而建立具有较高选择性的控制腰黄韧带肥厚增生的新途径。3.研究方法3.1材料和方法1)样本：本研究所获得样本,均来源于南方医科大学珠江医院脊柱外科腰椎骨折后路减压手术患者和腰椎盘突出症手术患者。其中腰椎骨折患者2例,腰椎间盘突出症患者11例,每名患者在术前均被告知将参加本研究,患者依据自愿的原则,参加本研究,并签署知情同意书。而本研究在开始之初即获得医院伦理委员会认可并通过。2)细胞的分离与培养无菌条件下,取腰椎骨折患者后路减压术中和腰椎间盘突出症患者后路椎板减压,髓核摘除术中的去除的黄韧带组织,标本在无菌条件下用显微解剖剪剪成约0.5mm3大小的组织块,磷酸盐缓冲盐水(PBS)充分洗涤,以除去血液成分。在无血清的DMEM (Gibco)培养液中加入0.2%Ⅰ型胶原酶(Sigma),37℃条件下消化60分钟,离心1000r/min,5min,弃消化液,然后用含血清的DMEM培养液洗涤消化后的组织块。在35mm培养皿中加入含有10% FBS (Gibco)的DMEM,将组织块均匀植入培养皿中,在37℃、5%C02、饱和湿度的孵箱中静置培养,种植密度约5×104/ml。每隔2天更换一次培养液。在倒置相差显微镜下观察原代细胞从组织块迁出情况,细胞达至原代细胞生长至80%融合时,0.2%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化,传代。取传3-5代的细胞用于试验。对细胞进行波形蛋白、Ⅰ型和Ⅲ型胶原的免疫荧光化学染色,检测细胞表型。3)黄韧带细胞活性检测四甲基偶氮唑盐(MTT) (Sigma)比色法分析传1、3、5代细胞(P1、3、5)的增殖特性。收集传1、3、5代黄韧带细胞,调整细胞密度至1×105,取100μl细胞悬液加入96孔板,即每孔种1×104细胞,放入培养箱培养；在不同时间点(0、24h、48h、72h)检测,吸去培养液,按每1ml完全培养基加入100μl MTT将二者混合均匀后,每孔加入100μl的5 mg/mL MTT液(Invitrogen Inc),37℃避光放置4h。然后吸除孔内培养上清,每孔各加入DMSO(Invitrogen Inc) 100μl,在酶联免疫检测仪在波长450nm处测量各孔的吸光值(OD)。试验中以只有培养基的为空白对照。上述实验重复3次,取均值。4)外源性TGF-β1/CTGF对黄韧带细胞的作用调细胞浓度为5×104个/m1,按每孔200u1接种于96孔板。常规培养24h后,细胞开始出现贴壁生长,改为无血清DMEM培养。无血清DMEM培养细胞24h后,将细胞分为5组,分别为含3ng/ml TGF-β1组、50ng/ml CTGF组,3ng/ml TGF-β1+1:500CTGF中和抗体封闭组,50ng/ml CTGF+1:500 CTGF中和抗体封闭组,对照组加入无血清DMEM;在常规条件下,继续培养24h。先进行MTT法检测细胞增殖。然后qRT-PCR检测CTGF, CollagenⅠA1, CollagenⅢA1 mRNA的表达变化。Western blot检测不同组CTGF表达。5)不同MAPKs通路在TGF-β1诱导CTGF表达中的作用通过加入阻断剂PD98509、SP600125、SB203580阻断ERK通路、JNK通路以及p38通路,观察在TGF-β1诱导下,对CTGF,CollagenⅠA1, CollagenⅢA1 mRNA表达的作用,筛选最佳的MAPKs通路。将生长状态良好的细胞分为5组,以无血清DMEM为对照组,刺激组又分为TGF-β1刺激组,以及ERK通路阻断组(PD98509 10 μM),p38通路阻断组(SB203580 100μM)和JNK通路阻断组(SP600125 10μM)。刺激组先加入通路抑制剂处理1 h,再用3ng/ml TGF-β1处理细胞24h。收集细胞后采用荧光定量PCR检测CTGF、Collagen I Al mRNA、 Collagen III Al mRNA的表达,选取通路。应用TGF-β1刺激,于各时间点(0h、2h、3h及6h)中止刺激,将细胞进行免疫荧光染色,观察p38和p-p38表达。分别收集TGF-β1刺激后不同时间点(0h、2h、3h及6h)的细胞(每组1×107),用Western blot险测p38、2p-p38 MAPKs通路的表达。6)通过p38 siRNA干扰,验证p38在TGF-β1诱导CTGF、I型胶原和Ⅲ型胶原表达中重要作用按每孔约1×104个细胞将细胞种于96孔板,种板24 h后换成无血清DMEM继续培养过夜后进行四种siRNA质粒转染。将转染后的细胞分为4组,以无血清DMEM+NC siRNA为对照组,无血清DMEM+p38 siRNA组和刺激组(3ng/ml TGF-β1 24h),刺激组又分为p38 siRNA+TGF-β1组和NC siRNA+TGF-β1组。然后qRT-PCR检测CTGF, CollagenⅠA1, CollagenⅢA1 mRNA的表达变化。Western blot检测不同组CTGF表达。7)定量RT-PCR研究所涉及的引物序列如下：CTGF 5’-GGAGTGGGTGTGTGACGAG-3’ Forward 5’-GTCTTCCAGTCGGTAAGCCG-3’ReverseCollagen Ⅰ 5’-AGATCTGAAGTGTGATGACTCAGG-3’ Forward 5’-CAGATCACGTCATCGCACAAC-3’ReverseCollagen Ⅲ 5’-ATGTTCCACGGAAACACTGG-3’ Forward 5’-GGAGAGAAGTCGAAGGAATGC-3’Reversep38 siRNA CGTGTTGCAGATCCAGACCA Forward GCCAGAATGCAGCCTACAGA ReverseGAPDH 5’-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3’ Forward 5’-TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3 ’Reverse每个样重复3次。用Agilent Stratagene荧光定量PCR仪Mx3000P进行荧光定量PCR实验。实验按照2-△△Ct方法处理数据。其中,ACt-=(目的基因Ct-内参Ct)的平均值±标准偏差；△△Ct=(待测样品中目的基因ACt-参照样品中目的基因△Ct)的平均值±标准偏差(若无参照样品则选择Ct最大的样品为参照进行计算)；相对样品初始模板量=(2-△△Ct)的平均值±标准偏差。8)统计学分析所有数据以均值±标准差(x±s)表示。采用one-way ANOVA检测,多重比较采用LSD法。对重复测量数据,可能存在交互效应的,采用two-way ANOVA检测。每个实验重复3次,P≤ 0.05表示差异有统计学意义。4.结果4.1人腰椎黄韧带细胞培养活性采用改良的组织块培养法,从13例后路腰椎手术所取的非肥厚的黄韧带标本进行原代培养,培养出黄韧带细胞,通过免疫荧光染色鉴定,均表现出典型的黄韧带细胞表型。所有黄韧带细胞均表达Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白、波形蛋白。通过MTT法对细胞增殖的分析,原代细胞同传代细胞生长速率无明显差异,同一代细胞增殖率在不同时间点(0h,24h,48h,72h)OD值有明显差异(P<0.05),而不同代细胞在同一时间点无明显差别(P>0.05)。在72小时内,传代培养的细胞与原代细胞的增殖一样,均随着时间的增加而增加。4.2 TGF-β1/CTGF提高人腰椎黄韧带细胞的增殖在第二部分试验中,TGF-β1和CTGF均明显提高黄韧带细胞的增殖。而加入CTGF中和抗体后可减弱TGF-β1和结缔组织生长因子对黄韧带细胞增殖的效应,这也意味着TGF-β1提高黄韧带细胞的增殖与CTGF有关。4.3 TGF-β1诱导CTGF、Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达以及细胞裂解液中CTGF的表达在这部分试验中,TGF-β1能够诱导CTGFmRNA的表达,而这种作用可以被CTGF中和抗体抑制。进一步试验结果：TGF-β1/CTGF均能显著增加ECM成分胶原Ⅰ和胶原Ⅲ mRNA表达。而同样的,CTGF中和抗体的存在可以抑制这种作用。对CTGF蛋白的检测也有类似的结果。另外,加入外源性CTGF可以增加黄韧带细胞中CTGF蛋白,但不能增加mRNA的表达,说明CTGF可以进入黄韧带细胞,但不能诱导CTGF mRNA生成,而CTGF中和抗体通过干扰CTGF与受体的联系,影响TGF-β1的作用。4.4 p38 MAPK是TGF-β1诱导CTGF,Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原蛋白mRNA表达信号通路,而不是JNK通路或ERK通路在第三部分试验中,JNK通路抑制剂SP600125和ERK通路抑制剂PD985059,不影响CTGF,Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达。而在细胞中加入p38MAPK通路抑制剂SB203580后,可以抑制p38通路的作用,影响TGF-β1诱导CTGF, I型胶原及Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达。p38和磷酸化p38的免疫荧光成像显示,它们的活性和表达与TGF-β1的持续时间有关。TGF-β1逐步轻度增加的黄韧带细胞中p38的表达。而显著升高的磷酸化p38的表达,显示TGF-β1可以激活p38蛋白激酶信号传导途径。4.5 TGF-β1可以活化p38和磷酸化p38,并使其在细胞中表达活性免疫荧光成像显示在黄韧带细胞中加入TGF-β1可以活化p38和磷酸化p38,并使其在细胞中表达活性(图3-4A)。TGF-β1随时间逐渐增加细胞中p38的表达量(P>0.05),而磷酸化p38的表达在TGF-β1存在的条件下,随时间增加,在1h时增加尤为明显(图3-4B)。与对照组有显著差别。(n=3;*P<0.05 vs. control)。4.6 p38 siRNA减低TGF-β1作用细胞免疫荧光可见对照组细胞染色呈阳性反应,但胞浆染色弱,但有p38、p-p38表达；p38 siRNA组胞浆染色呈阴性反应,无p38、p-p38表达。而加入3ng/ml TGF-β1两组均有阳性反应,NC siRNA+TGF-β1组胞浆染色呈强反应,而p38siRNA+TGF-β1组胞浆染色弱。荧光定量PCR检测可见p38 siRNA组,3种mRNA表达明显低于其它组,与对照组有显著性差异(n=3;*P<0.05 vs. NC siRNA)。而加入TGF-β1后可以提高p38 siRNA沉默后,黄韧带细胞中CTGF、Collagen Ⅰ A1、Collagen Ⅲ A的mRNA基因表达,但与NC siRNA+TGF-β1组差异更加明显(n=3;#P<0.05 vs. TGF-β1+NC siRNA)。Western-blot险测CTGF蛋白表达结果与PCR结果类似,p38 siRNA组,CTGF表达明显低于其它组,与对照组有显著性差异(n=3;*P<0.05 vs. NC siRNA).而加入TGF-β1后虽可以提高p38 siRNA沉默后,黄韧带细胞中CTGF蛋白表达,但与NC siRNA+TGF-β1组仍有显著性差异(n=3;#P<0.05 vs. TGF-β1+NC siRNA)。由此可知,p38 MAPK通路在TGF-β1调节黄韧带肥厚、增生过程中起关键作用。5.讨论腰椎管狭窄的黄韧带细胞基质中富含Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白和波形蛋白,和培养的细胞进行的LF细胞表型表达一致,均表达Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的,以及波形蛋白。黄韧带肥厚是引起腰椎管狭窄症主要原因,并可使其进展。目前认为黄韧带增生、肥厚的病变过程是多种因素共同作用的结果,如椎体节段、年龄、椎体屈伸活动及受力情况、生长因子参与等。连续的机械应力会导致黄韧带变性。弹性纤维丢失、组织纤维化,胶原组织增多是退变的黄韧带共同的病理特征。对TGF-β1与黄韧带肥厚之间的关系尚不清楚。本研究发现TGF-β1可以提高细胞内CTGFmRNA和胞浆中蛋白水平,更加支持文献关于两者之间存在相互作用的报道[33]。加入CTGF中和抗体可以降低对三种mRNA的表达,表明TGF-β1是通过CTGF引起黄韧带肥厚的。而最后的研究证实p38 MAPK是MAPKs中最关键的信号通路。先前的研究认为TGF-β1和CTGF都可以促进细胞增殖,而在本研究中,TGF-β1促进细胞增殖的作用是与CTGF相关的,加入CTGF中和抗体,TGF-β1不能促进黄韧带细胞增殖。此外,TGF-β1和CTGF一起促进细胞基质成分的合成[34]。黄韧带肥厚主要病理变化就是胶原成分增加,黄韧带细胞有典型的成纤维细胞表型[13]。人黄韧带中Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原占比重高[34]。TGF-β1诱导Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原蛋白mRNA, CTGFmRNA及CTGF蛋白的表达,而这种上调作用,可以被中和抗体阻断。因此TGF-β1是通过CTGF影响黄韧带肥厚的。一般认为TGF-β1信号通路是Smads,而活化Smads通路时,可以通过其他激酶,活化MAPKs通路。研究显示p38和ERK是促纤维活性信号,JNK是抑制纤维活性信号[33]。p38 MAPK通路抑制剂SB203580可以抑制TGF-βi诱导CTGF,Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达。显示p38是成纤维活性。另外,TGF-β1可以提高p38表达和磷酸化的水平,沉默p38 MAPK后,p38、CTGF、Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达均下降。进一步证实了p38通路是TGF-β1活化主要通路,p38具有成纤维活性。总之,黄韧带增生肥厚与其它退变因素一起,加重腰椎管狭窄进展,导致脊髓、神经根受压,造成老年人运动功能障碍。目前临床上对于黄韧带肥厚所引起的腰椎管狭窄症患者,缺少有效的药物保守治疗手段。本研究认为TGF-β1通过p38 MAPK途径增加CTGF表达,从而提高黄韧带细胞胶原纤维数量,导致黄韧带肥厚。研究结果对评估腰椎管狭窄病理机制,早期预防、诊断腰椎管狭窄有一定的意义,同时也为该疾病治疗,提供新的选择。6.结论本研究证实在腰黄韧带肥厚增生过程中,TGF-β1主要通过P38通路调控CTGF表达,用mRNA干扰技术选择性阻断p38通路,可减低TGF-β1诱导CTGF,Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达水平,减低CTGF蛋白,可以抑制黄韧带肥厚增生过程。但是,本研究只是一次初步探讨和尝试,对黄韧带肥厚的机制仍需要深入研究。