雄烯二酮（AD）是甾体激素药物合成的核心中间体。新金分枝杆菌代谢甾醇转化AD过程会产生副产物丙酰辅酶A,它在胞内积累会产生毒性,抑制菌株生长。本文基于代谢组学和转录组学数据,通过强化菌株内源的丙酰辅酶A代谢途径,实现菌株的解毒,提高菌株的AD转化率。为了使改造菌更适用于工业生产,尝试在新金分枝杆菌中构建CRISPR基因编辑系统,将本文强化基因整合至菌株的基因组,构建稳定高效的工业生产菌,为实现工业化高产AD奠定基础。通过在新金分枝杆菌QC M3（MNR M3△Ksd D）中强化胞膜甲基支链脂质合成途径的丙酰辅酶A羧化酶AccA1基因和聚酮合酶AccD1基因,构建基因工程菌QC M3-A和QC M3-D,结果表明,QC M3-A胞内丙酰辅酶A含量最高时较原始菌降低了21.30%;并且在168 h时,菌株的AD转化率可达92.58%,比同期原始菌的AD转化率提高了9.62%;且强化菌株的AD耐受性较原始菌株较强,但菌株在强化胞膜甲基脂质合成途径后菌株的生长速率及菌体量明显降低。比较MNR M3和QC M3的转录组数据,定位到一种差异基因D17402905,属于AraC型转录调控因子,可调控下游酰基转移酶的表达。通过在新金分枝杆菌QC M3中回补AraC基因及下游的氮乙酰转移酶NAT基因,构建基因工程菌QC M3-C和QC M3-N,结果表明,QC M3-C胞内丙酰辅酶A含量最高时较原始菌下降了38.70%,该菌的AD转化率在168 h时较同期的原始菌提高了7.73%。说明胞内丙酰辅酶A含量并不是唯一的限速反应。同时发现强化AraC可使菌株加速生长。根据上述实验结果对基因工程菌株进行优化,构建了串联过表达菌株QC M3-TA、QC M3-AC、QC M3-CTA。在96h时,QC M3-CTA的AD转化率已达90.70%,接近了单基因过表达菌株在168 h时的最高转化率,缩短了转化周期。168 h时,其最高AD转化率可达96.88%,较原始菌QC M3提高了13.93%。以pMV261为基础质粒,将适合分枝杆菌的FnCpf1切割蛋白和crRNA特异性引导序列一同克隆到其中,构建p CRISPR。该系统只需单抗性基因进行筛选,并且在基因编辑完成后,仅需通过升温的方式,减弱质粒上Ori M PAL5000温敏复制子的活性,即可完成系统的丢失,实现无抗性生产。目前构建的系统已成功在大肠杆菌中敲除报告基因GFP。但在新金分枝杆菌中应用时却未获得阳性克隆子,经过一系列实验的验证发现编辑系统失效原因可能是新金分枝杆菌的基因组修复机制较弱,仍需双质粒系统,具体原因有待进一步研究。