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本文从以下几个方面进行论述。 第一部分 PK2对大鼠睾丸免疫细胞亚群和iNOS的影响 目的：研究PK2对睾丸免疫细胞亚群和iNOS的影响，初步探讨PK2对睾丸免疫微环境的影响。 方法：将PK2蛋白（分为50pmol、100pmol、300pmol）通过睾丸网注射到成年SD大鼠睾丸，对照组给予生理盐水，每组12只，一周后取睾丸做HE染色。各组睾丸经胶原酶Ⅰ消化，淋巴细胞分离液分离后，流式细胞术检测PK2注射组睾丸间质免疫细胞亚群的变化。免疫组织化学法检测升高组iNOS表达情况。 结果：随着PK2蛋白剂量的增加，睾丸形态学呈现不同程度的改变，间质内血管和细胞增多，生精上皮萎缩，脱落，尤其以300pmol表现最明显。流式细胞术显示随着剂量的增加，睾丸间质内免疫细胞数量增多，尤其以CD8+淋巴细胞、ED1+ED2-、ED1-ED2+、ED1+ED2+巨噬细胞数量增加明显，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。iNOS表达水平升高,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。 结论：PK2影响睾丸间质内的免疫细胞数量及亚群，增加iNOS表达水平，影响睾丸免疫平衡。 第二部分 PK2siRNA睾丸内干扰效果 目的：PK2表达质粒与化学合成的PK2干扰序列共转染HEK293细胞，筛选出PK2的有效干扰序列，观察其在乳鼠睾丸内的干扰效果。 方法：针对大鼠PK2mRNA序列设计三条不同的干扰序列（siPK2-S1，S2，S3），通过将Cy3荧光标记的对照siRNA稀释成20nM、30nM、50 nM和100nM四个浓度梯度，确定最佳转染浓度。在阳离子脂质体Lipfectamine2000介导下，将PK2表达质粒与三段siRNA序列共转染HEK293细胞，按实验要求分为阳性对照组（加PK2表达质粒，P）、阴性对照组（转染阴性siRNA序列，N）、实验组（S1，S2，S3）。采用实时荧光定量PCR检测转然后48h各组细胞PK2mRNA表达情况。采用Clontech试剂盒检测转染72h后 PK2蛋白表达情况，确定最有效的干扰序列。最有效干扰序列经FAM修饰后通过睾丸网注射到生后12天的雄性SD乳鼠睾丸，对照组注射阴性对照序列，每组6只。一周后取睾丸做HE染色。RT-PCR检测PK2mRNA在睾丸中的表达情况。免疫组织化学检测PK2蛋白表达情况。 结果：Cy3-siRNA20nM组可见微弱的红色荧光，随着Cy3-siRNA浓度的增加荧光强度增强，50nM大多数细胞荧光强度最强，选定50nM作为PK2干扰序列的有效浓度。共转染HEK293细胞后，PK2mRNA相对表达量和PK2蛋白表达较阳性对照组降低，差异有统计学意义（P＜0.05），以序列S1干扰效果最明显。干扰组乳鼠睾丸形态改变不明显，PK2 mRNA表达降低，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05)。免疫组化初级精母细胞染色阳性细胞数量减少。 结论：筛选出的siPK2-S1序列为PK2靶序列的有效干扰序列，可以降低PK2在睾丸内的表达。