核桃(Juglans L.)产业化的必经之路是实现良种无性繁殖,扦插是木本植物主要的繁殖方式,而核桃属于难生根植物,尤其采用栽培品种和成龄植株为试材时不定根发生极难,这一现象对许多经济林树种而言具普遍性。在前人研究基础上,本实验室经过多年试验,采用嫁接和埋干黄化等措施将成龄插穗复幼,成功地诱导了核桃等许多难生根木本植物不定根发生。但目前针对复幼处理促进不定根发生能力的生理机制研究,特别是关于不定根发生的关键调控因素--植物内源激素和外源生长调节剂的作用原理,还缺乏深入的认识。所以本研究以核桃品种‘中宁盛’为试材,建立了多激素免疫胶体金定位技术体系,从组织、生理及分子水平上研究了核桃嫩枝插穗复幼前后不定根发生的调控机制,获得以下主要结果:一、改进适用于核桃半木质化材料的石蜡组织切片法,改良了适于半木质化样本的石蜡组织切片免疫组织化学定位体系,具体改进是:用多聚甲醛和戊二醛固定剂对核桃插穗半木质化材料进行固定;烤片时用40℃可保持既不脱片并保存抗原活性;适宜免疫组化反应的抗体稀释倍数分别是,吲哚乙酸(IAA)和脱落酸(ABA)是一抗50×和二抗50×,赤霉素(GA3)和玉米素核苷(ZR)是一抗100×和二抗50×;最佳银扩增显影条件为26℃下15~20 min。二、经组织学观察发现核桃复幼插穗的不定根原基发生于髓射线正对的形成层和韧皮部的交叉区域。在已有高生根率、长势一致的核桃嫩枝扦插体系的基础上,即扦插20d后核桃品种‘中宁盛’的复幼插穗生根率达到98.1%,而未经复幼处理(成龄)的插穗没有不定根发生。复幼插穗扦插3d时形成层细胞开始旺盛分裂,第4d形成层明显增厚,随后产生分生组织,7d时可观察到细胞分裂引起的根原始细胞发生,9d时根原基形成并向外生长,15d时不定根发育完全。三、复幼处理改变了核桃插穗的内源激素水平。采用连续组织切片通过免疫组织化学测定,结合对复幼扦插过程多种内源激素的高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS)测定,同步研究了不定根发生过程中内源IAA、ABA、GA3、ZR和玉米素(ZT)的时空分布及动态变化。发现不定根诱导初期,多种植物激素主要分布于成熟插穗和复幼插穗基部的韧皮部筛管和伴胞中。并且,复幼插穗中IAA水平高于成熟插穗,而ABA、GA3和ZR水平则是成熟插穗中高。四、发现复幼插穗在生根诱导过程中的多激素时空分布特征。发现GA3早于IAA、ABA和ZR分布在韧皮部筛管和其伴胞以外的细胞中,随后在形成层和韧皮部的交叉区域中观察到IAA积累,并且根原基发生于此。但是,在成熟插穗中四种植物激素一直主要在筛管和伴胞中分布。因此,筛管及其伴胞中多种植物激素水平的改变和相关激素活性的提高,尤其在形成层和韧皮部交叉部分IAA水平的提高可能解释复幼处理提高不定根发生能力的原因。并进一步根据研究结果提出核桃复幼插穗的植物激素时空变化模型。五、外源IBA诱导调控插穗内源激素改变是促进不定根发生的另一重要因素。外源生长素诱导处理对核桃插穗生根率有显著影响,IBA诱导处理的插穗在扦插过程中内源激素变化明显,IAA和GA3逐渐升高,于5d时分生组织形成时达到峰值后降低;ABA先降低,至7d时短暂回升后再下降;ZT于5d后才开始升高。六、采用核桃插穗扦插不同天数的RNA-seq数据和激素含量变化进行关联分析,发现PIN6、ABP19、SAUR21、GA2ox和GA20ox2等5个基因与激素含量变化相关,GO和KEGG分析表明这些基因主要参与生长素运输(PIN6)、响应外源生长调节剂诱导响应(SAUR21)、生长素信号转导受体(ABP19)和赤霉素合成(GA2ox和GA20ox2)。本研究在组织化学、生理生化及分子水平上阐释核桃复幼处理促进根原基发生的内源激素互作机制方面有创新。