背景食管癌是常见的消化道恶性肿瘤,严重危及人类生命和健康。食管癌主要有鳞状细胞癌和腺癌两种类型,与西方国家不同,我国以鳞状细胞癌为主。近年来,随着食管癌早期诊断及早期治疗的开展,其预后虽然有所改善,但患者整体的5年生存率依旧低下,肿瘤侵袭转移仍是导致患者术后复发和死亡的重要原因。因此,从分子水平探讨食管癌的侵袭转移机制,找到针对食管癌侵袭转移的有效治疗靶点,对于改善患者预后和提高患者生活质量具有重要意义。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是胚胎发育、组织重建和伤口修复中的基础过程,同时也是恶性肿瘤浸润、转移的重要机制之一。在恶性肿瘤EMT过程中,上皮性标志物E-cadherin表达下调,间质性标志物Vimentin表达上调,细胞粘附能力下降,迁移能力增强,肿瘤细胞更容易发生侵袭和转移。目前较为公认的调控EMT的关键性转录因子主要包括Twist、Snail及ZEB(zinc finger E-box-binding homeobox)等。ZEB家族即E盒结合锌指蛋白,包括ZEB1和ZEB2两个成员。ZEB1可通过其锌指结构与E-cadherin基因启动子区域的E-box结合而直接抑制E-cadherin的表达,从而启动EMT过程。此外,ZEB1还可通过诱导肿瘤细胞EMT过程而显著增强肿瘤的侵袭迁移能力。信号转导子和转录激活子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)是白细胞介素-6(Interleukin 6,IL-6)信号传递过程中的一种急性期反应因子(acute phase response factor,APRF),因其在人类多种肿瘤中异常高表达,并与肿瘤的增殖、分化、细胞凋亡、血管生成、浸润转移以及免疫逃逸密切相关,所以备受关注。新近的研究发现,异常激活的STAT3信号通路通过调控EMT参与肿瘤的侵袭转移。STAT3可通过调控EMT相关转录因子Twist,Snail及ZEB等,影响EMT表型,改变肿瘤细胞的生物学特性,从而参与肿瘤的发生发展及侵袭转移。目前,有关STAT3/ZEB1/E-cadherin信号轴在食管鳞癌EMT中的作用及机制研究尚未见报道。目的为了探讨STAT3/ZEB1/E-cadherin信号轴在食管鳞癌EMT中的作用及分子机制,本研究首先检测食管鳞癌组织中p-STAT3、E-cadherin、Vimentin及ZEB1的表达,分析p-STAT3与食管鳞癌EMT及侵袭转移的关系。其次通过外源性IL-6刺激和STAT3 sh RNA稳定转染分别激活和抑制食管鳞癌细胞STAT3信号通路后,检测E-cadherin、Vimentin、ZEB1的表达变化,以及对细胞侵袭和迁移能力的影响。再次通过ZEB1 sh RNA干扰,观察食管鳞癌细胞中STAT3诱导的EMT是否通过ZEB1发挥作用。另外,通过染色质免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipitation,Ch IP)和基因测序,分析STAT3和ZEB1基因启动子是否存在结合位点。最后,在食管癌裸鼠移植瘤中利用STAT3 sh RNA和ZEB1 sh RNA阻断STAT3/ZEB1/E-cadherin信号后,观察其对移植瘤生长及EMT的影响。第一部分STAT3及EMT相关因子在人食管鳞状细胞癌组织中的表达及意义方法1.采用免疫组织化学的方法检测90例人食管鳞状细胞癌组织及相应正常食管粘膜组织中p-STAT3、E-cadherin、Vimentin及ZEB1蛋白的表达情况。2.分析p-STAT3蛋白表达与EMT相关因子E-cadherin、Vimentin、ZEB1的关系以及与性别、年龄、肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及肿瘤TNM分期等临床病理参数的关系。结果1.90例人食管鳞状细胞癌组织中,p-STAT3蛋白表达(54.44%)明显高于相应正常食管粘膜组织(27.78%,P<0.01),且与肿瘤浸润深度(浅层组vs深层组:31.82%vs 61.76%)、淋巴结转移(无vs有:46.97%vs 75.00%)及TNM分期(ⅠvsⅡvsⅢ:34.78%vs 52.00%vs 66.67%)呈正相关(P<0.05),而与性别、年龄及肿瘤组织学分级无关(P>0.05)。2.90例人食管鳞状细胞癌组织中,ZEB1蛋白表达(62.22%)明显高于相应正常食管粘膜组织(23.33%,P<0.01),且与肿瘤浸润深度(浅层组vs深层组:40.91%vs 69.12%)及淋巴结转移(无vs有:56.06%vs 79.17%)呈正相关(P<0.05),而与性别、年龄、肿瘤组织学分级及TNM分期无关(P>0.05)。3.90例人食管鳞状细胞癌组织中,E-cadherin蛋白表达(38.89%)明显低于相应正常食管粘膜组织(100.0%,P<0.01),且与肿瘤浸润深度(浅层组vs深层组:68.18%vs 29.41%)、淋巴结转移(无vs有:46.97%vs 16.67%)及TNM分期(ⅠvsⅡvsⅢ:69.57%vs 28.00%vs 28.57%)呈负相关(P<0.01),而与性别、年龄及肿瘤组织学分级无关(P>0.05)。4.90例人食管鳞状细胞癌组织中,Vimentin蛋白表达(33.33%)明显高于相应正常食管粘膜组织(0.00%,P<0.01),且与肿瘤淋巴结转移(无vs有:24.24%vs 58.33%)呈正相关(P<0.01),与肿瘤组织学分级(ⅠvsⅡvsⅢ:23.08%vs 44.90%vs 13.33%)相关(P<0.05),而与性别、年龄、肿瘤浸润深度及TNM分期无关(P>0.05)。5.人食管鳞状细胞癌组织中,E-cadherin蛋白表达与Vimentin呈负相关(γs=–0.226,P<0.05);p-STAT3蛋白表达与E-cadherin呈负相关(γs=–0.277,P<0.01)而与Vimentin呈正相关(γs=0.221,P<0.05);ZEB1蛋白表达与E-cadherin呈负相关(γs=–0.507,P<0.01)而与Vimentin无关(γs=0.065,P>0.05);p-STAT3蛋白表达与ZEB1呈正相关(γs=0.300,P<0.01)。第二部分STAT3/ZEB1/E-cadherin信号轴的表达调控对人食管鳞癌细胞上皮间质转化及侵袭迁移能力的影响方法1.Real-time PCR及western blot方法检测EC-1、Eca109、EC9706及TE-1四种人食管鳞状细胞癌细胞中STAT3 m RNA及p-STAT3蛋白含量,并采用正常人食管鳞状上皮细胞(normal esophageal epithelial cells,NEECs)作对照。2.外源性IL-6刺激STAT3低表达的TE-1细胞株,real-time PCR及western blot方法检测STAT3的活化效果以及对E-cadherin、Vimentin及ZEB1表达的影响,倒置显微镜观察细胞形态学改变,侵袭小室实验及划痕实验检测细胞侵袭迁移能力的变化。3.STAT3 sh RNA稳定转染STAT3高表达的EC-1及Eca109细胞株,real-time PCR及western blot方法检测STAT3的抑制效果以及对E-cadherin、Vimentin及ZEB1表达的影响,倒置显微镜观察细胞形态学改变,侵袭小室实验及划痕实验检测细胞侵袭迁移能力的变化。4.ZEB1 sh RNA稳定转染STAT3高表达的EC-1及Eca109细胞株,real-time PCR及western blot方法检测ZEB1的抑制效果以及对E-cadherin、Vimentin表达的影响,侵袭小室实验及划痕实验检测细胞侵袭迁移能力的变化。5.外源性IL-6刺激ZEB1 sh RNA稳定转染的EC-1及Eca109细胞,real-time PCR及western blot方法检测E-cadherin及Vimentin的表达,侵袭小室实验及划痕实验检测细胞侵袭迁移能力的变化。6.采用Ch IP方法检测EC-1及Eca109细胞中p-STAT3与ZEB1基因启动子区结合情况,并对结合片段进行测序分析,寻找p-STAT3在ZEB1基因启动子区的结合位点。结果1.STAT3 m RNA及p-STAT3蛋白在EC-1(5.71±0.45,0.68±0.09)、Eca109(5.11±0.33,0.65±0.06)、EC9706(5.47±0.38,0.46±0.07)及TE-1(4.46±0.33,0.37±0.06)四种食管鳞癌细胞中的表达水平均明显高于NEECs(1.00±0.00,0.19±0.08),差异有统计学意义(P<0.01)。在m RNA水平,四种鳞癌细胞的表达水平为EC-1>EC9706>Eca109>TE-1,EC-1和EC9706与TE-1相比,差异有统计学意义(P<0.05);在蛋白(磷酸化)水平,四种鳞癌细胞的表达水平为EC-1>Eca109>EC9706>TE-1,EC-1和Eca109与EC9706和TE-1相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。2.外源性IL-6刺激STAT3低表达的TE-1细胞株后,与空白对照组细胞相比,STAT3 m RNA(2.75±0.36 vs 1.00±0.00)及p-STAT3蛋白(0.56±0.09 vs0.35±0.07)表达明显活化(P<0.05),细胞形态由上皮细胞特性向间质细胞特性转变,E-cadherin m RNA(0.51±0.08 vs 1.00±0.00)及蛋白(0.38±0.10 vs 0.59±0.09)表达明显下调(P<0.05),Vimentin m RNA(2.48±0.35 vs 1.00±0.00)及蛋白(0.46±0.08 vs 0.28±0.08)明显上调(P<0.05),ZEB1 m RNA(2.31±0.36 vs1.00±0.00)及蛋白(0.48±0.09 vs 0.25±0.06)明显上调(P<0.05),细胞侵袭(100±10vs 77±8)及迁移(0.55±0.10 vs 0.32±0.06)能力明显增强(P<0.05)。3.STAT3 sh RNA稳定转染STAT3高表达的EC-1及Eca109细胞株后,与阴性对照(无义序列)组和空白对照组细胞相比,STAT3 m RNA(EC-1:0.26±0.05vs 0.91±0.07 vs 1.00±0.00,Eca109:0.28±0.08 vs 0.90±0.07 vs 1.00±0.00)及p-STAT3蛋白(EC-1:0.25±0.07 vs 0.46±0.08 vs 0.52±0.07,Eca109:0.38±0.08 vs0.61±0.07 vs 0.56±0.07)表达明显抑制(P<0.05),细胞形态由间质细胞特性向上皮细胞特性转变,E-cadherin m RNA(EC-1:2.10±0.12 vs 0.96±0.08 vs 1.00±0.00,Eca109:2.13±0.10 vs 0.93±0.07 vs 1.00±0.00)及蛋白(EC-1:0.67±0.07 vs 0.47±0.08vs 0.48±0.06,Eca109:0.69±0.08 vs 0.49±0.05 vs 0.49±0.06)表达明显上调(P<0.05),Vimentin m RNA(EC-1:0.80±0.06 vs 1.04±0.10 vs 1.00±0.00,Eca109:0.70±0.06 vs 0.95±0.07 vs 1.00±0.00)及蛋白(EC-1:0.42±0.05 vs 0.65±0.08 vs0.63±0.09,Eca109:0.43±0.07 vs 0.62±0.08 vs 0.61±0.10)明显下调(P<0.05),ZEB1 m RNA(EC-1:0.60±0.08 vs 0.92±0.06 vs 1.00±0.00,Eca109:0.56±0.09 vs0.90±0.06 vs 1.00±0.00)及蛋白(EC-1:0.23±0.07 vs 0.48±0.08 vs 0.52±0.04,Eca109:0.54±0.08 vs 0.60±0.07 vs 0.58±0.06)明显下调(P<0.05),细胞侵袭(EC-1:74±8 vs 97±11 vs 102±14,Eca109:63±9 vs 86±10 vs 90±10)及迁移(EC-1:0.41±0.08 vs 0.71±0.11 vs 0.76±0.06,Eca109:0.43±0.08 vs 0.77±0.10 vs 0.68±0.08)能力明显减弱(P<0.05)。4.ZEB1 sh RNA稳定转染STAT3高表达的EC-1及Eca109细胞株后,与阴性对照(无义序列)组和空白对照组细胞相比,ZEB1 m RNA(EC-1:0.33±0.07vs 1.01±0.08 vs 1.00±0.00,Eca109:0.32±0.05 vs 0.93±0.05 vs 1.00±0.00)及蛋白(EC-1:0.25±0.06 vs 0.61±0.08 vs 0.56±0.09,Eca109:0.36±0.05 vs 0.61±0.07 vs0.55±0.06)表达明显抑制(P<0.05),E-cadherin m RNA(EC-1:1.96±0.26 vs0.96±0.06 vs 1.00±0.00,Eca109:2.13±0.10 vs 0.93±0.07 vs 1.00±0.00)及蛋白(EC-1:0.61±0.06 vs 0.46±0.07 vs 0.48±0.06,Eca109:0.67±0.06 vs 0.47±0.07 vs0.49±0.06)表达明显上调(P<0.05),Vimentin m RNA(EC-1:0.79±0.06 vs1.04±0.09 vs 1.00±0.00,Eca109:0.71±0.03 vs 0.95±0.07 vs 1.00±0.00)及蛋白(EC-1:0.37±0.08 vs 0.56±0.06 vs 0.60±0.06,Eca109:0.43±0.07 vs 0.54±0.05 vs0.64±0.07)明显下调(P<0.05),细胞侵袭(EC-1:63±7 vs 97±11 vs 102±14,Eca109:64±8 vs 86±10 vs 90±10)及迁移(EC-1:0.36±0.08 vs 0.71±0.11 vs0.76±0.06,Eca109:0.44±0.10 vs 0.77±0.10 vs 0.68±0.08)能力明显减弱(P<0.05)。5.外源性IL-6刺激ZEB1 sh RNA稳定转染的EC-1及Eca109细胞后,与阴性对照(无义序列)组和空白对照组细胞相比,E-cadherin m RNA(EC-1:1.78±0.10 vs 1.03±0.06 vs 1.00±0.00,Eca109:1.87±0.13 vs 0.97±0.09 vs 1.00±0.00)及蛋白(EC-1:0.57±0.06 vs 0.34±0.07 vs 0.27±0.07,Eca109:0.59±0.07 vs 0.41±0.07vs 0.32±0.06)表达无明显下调(P<0.05),Vimentin m RNA(EC-1:0.76±0.07 vs0.96±0.08 vs 1.00±0.00,Eca109:0.73±0.05 vs 0.98±0.05 vs 1.00±0.00)及蛋白(EC-1:0.40±0.07 vs 0.63±0.06 vs 0.70±0.06,Eca109:0.44±0.08 vs 0.68±0.08 vs0.70±0.07)表达无明显上调(P<0.05),细胞侵袭(EC-1:72±8 vs 107±12 vs112±13,Eca109:77±8 vs 99±8 vs 99±9)及迁移(EC-1:0.57±0.11 vs 0.82±0.10 vs0.86±0.07,Eca109:0.53±0.11 vs 0.81±0.09 vs 0.86±0.08)能力无明显增强(P<0.05)。6.通过Ch IP及测序分析,发现EC-1细胞p-STAT3结合位点位于ZEB1基因2339-2527、3306-3586、2566-2965和3622-3970区域,Eca109细胞p-STAT3结合位点位于ZEB1基因3306-3586、2566-2965和3622-3970区域。第三部分STAT3/ZEB1/E-cadherin信号轴阻断对裸鼠食管鳞癌移植瘤生长及EMT的影响方法1.STAT3 sh RNA稳定转染的EC-1细胞、ZEB1 sh RNA稳定转染的EC-1细胞、无义对照NC sh RNA稳定转染的EC-1细胞及空白EC-1细胞分别注射到裸鼠腋下构建食管鳞癌移植瘤动物模型,每组7只。2.每4天测量移植瘤体积,并绘制肿瘤生长曲线图。实验结束后,每组选取五只裸鼠,取瘤称重,测量体积并拍照。3.HE染色观察食管鳞癌移植瘤组织学形态,real-time PCR及免疫组织化学方法检测四组移植瘤组织中STAT3、ZEB1、E-cadherin及Vimentin m RNA和蛋白的表达。结果1.与阴性对照组和空白对照组相比,STAT3 sh RNA组裸鼠食管鳞癌移植瘤生长受抑,肿瘤体积(mm3)(775±315 vs 1543±182 vs 1507±206)和重量(g)(0.61±0.09 vs 1.32±0.23 vs 1.54±0.31)明显减小(P<0.01)。2.与阴性对照组和空白对照组相比,ZEB1 sh RNA组裸鼠食管鳞癌移植瘤生长受抑,肿瘤体积(mm3)(933±55 vs 1543±182 vs 1507±206)和重量(g)(0.72±0.07 vs 1.32±0.23 vs 1.54±0.31)明显减小(P<0.01)。3.与阴性对照组和空白对照组相比,STAT3 sh RNA组STAT3 m RNA(0.34±0.09 vs 0.93±0.11 vs 1.00±0.00)及p-STAT3蛋白(阳性细胞数/200个细胞)(96±11 vs 133±17 vs 139±14)表达明显抑制(P<0.01),细胞形态由间质细胞特性向上皮细胞特性转变,E-cadherin m RNA(1.55±0.19 vs 0.93±0.07 vs1.00±0.00)及蛋白(110±11 vs 84±9 vs 91±9)表达明显上调(P<0.05),Vimentin m RNA(0.78±0.05 vs 0.91±0.05 vs 1.00±0.00)明显下调(P<0.05),但Vimentin蛋白(107±14 vs 127±17 vs 125±19)无明显下调(P>0.05)。4.与阴性对照组和空白对照组相比,ZEB1 sh RNA组ZEB1 m RNA(0.43±0.07vs 0.88±0.10 vs 1.00±0.00)及蛋白(91±17 vs 115±16 vs 113±12)表达明显抑制(P<0.05),E-cadherin m RNA(1.32±0.14 vs 0.93±0.07 vs 1.00±0.00)及蛋白(108±14vs 84±9 vs 91±9)表达明显上调(P<0.05),Vimentin m RNA(0.81±0.05 vs0.91±0.05 vs 1.00±0.00)明显下调(P<0.05),Vimentin蛋白(107±15 vs 127±17vs 125±19)无明显下调(P>0.05)。结论1.人食管鳞状细胞癌组织中,STAT3与ZEB1表达相关,且与肿瘤EMT及侵袭转移相关,提示STAT3可能通过ZEB1参与食管鳞状细胞癌EMT及侵袭转移。2.人食管鳞状细胞癌细胞中,STAT3与ZEB1基因启动子区之间存在结合位点,STAT3可通过直接调控ZEB1表达,影响细胞EMT及侵袭迁移。因此,STAT3/ZEB1/E-cadherin信号轴是食管鳞状细胞癌EMT及侵袭转移的重要分子机制。3.针对STAT3及ZEB1的sh RNA能有效阻断STAT3/ZEB1/E-cadherin信号轴,逆转食管鳞癌裸鼠移植瘤EMT表型,并抑制移植瘤生长。因此,STAT3/ZEB1/E-cadherin信号轴可作为食管鳞癌分子靶向治疗的有效靶点。