棉花GaMYB7和GbGLU基因启动子的克隆和初步功能验证

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棉花是第一大天然纤维产物,在世界纺织工业中具有重要的经济地位。随着人们生活水平的提高和纺织技术的进步,也对棉纤维品质提出了更高的要求。而阐明纤维发育的细胞和分子机理,发现改良棉纤维的靶基因,是改良纤维品质的基础。研究这些棉花纤维特异基因的启动子既有助于进一步明确该基因的功能,也为基因工程的研究打下了基础。棉花黄萎病(Verticillium spp)是棉花生长过程中最具破坏力的病害之一,在世界范围内流行。在我国,棉花黄萎病是棉花生产的主要障碍之一。使用棉花黄萎病病原诱导的启动子来介导抗病基因的表达,不仅会获得目的产物、达到预定目标,而且也不会产生副作用。植物抗病相关启动子的调控特性研究、分离及其应用对于提高植物抗病性极其关键。本研究选取了两个目标基因,棉花花和纤维特异表达基因GaMYB7和棉花黄萎病诱导表达基因GbGLU,克隆了这两个基因的启动子序列,具体工作如下:(1)通过筛选江陵中棉BAC文库的方法,得到了含有GaMYB7基因的阳性单克隆,以此作为TAIL-PCR的起始模板,获得的总长度1566bp的GaMYB7基因上游序列。经过序列分析确定了转录起始位点(TSS)、TATA box和CAATbox。通过序列分析发现,该序列包含多个光调控元件,还具有生长素和赤霉素应答的基本结构。在此基础上,构建了3个5’端启动子片段驱动GUS基因的植物表达载体。通过基因枪转化棉花胚珠瞬时表达实验发现,三个启动子片段均能指导报告基因在棉花胚珠中正常表达。TM-1棉花0DPA胚珠离体诱导实验表明,GaMYB7基因的表达受GA3和IAA浓度的影响,10uMIAA时,GaMYB7基因的表达量最高;但是过高浓度的GA3会抑制GaMYB7基因的表达。在20001x的光照强度下诱导处理棉花胚珠发现,与暗处理相比,早期(10天之前)光照处理可以有效提高GaMYB7基因的表达量;后期(10天之后)反而会抑制GaMYB7基因的表达。因此,GaMYB7启动子可用于研究棉花纤维的发育、品质改良以及外源基因在棉花纤维中的特异表达。(2)通过筛选陆地棉遗传标准系TM-1 BAC文库,得到了GbGLU基因的阳性单克隆,以此作为TAIL-PCR的起始模板,分离了GbGLU基因5’侧翼序列,总长度为1357bp。PLACE分析表明,该序列含有TATA box和CAAT box,还有病原菌诱发子反应元件W-box、GT-1、MYB、MYBST1等。将GbGLU基因5’侧翼序列以不同的缺失与GUS基因融合构建了3个植物表达载体。通过农杆菌介导转化棉花胚性愈伤发现,三个启动子片段均能指导报告基因在棉花愈伤中表达。GbGLU启动子能否用于棉花抗黄萎病的转基因研究还需进一步实验证明。
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