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背景与目的创伤后骨折不愈合和骨缺损是骨科医生面临的难题之一。目前,利用干细胞和合成移植材料传递生长因子到达骨损伤部位,由生长因子促进骨的修复能力,进而有效地治疗骨折不愈合和骨缺损等,是骨科基础研究的热点及重点。脂肪干细胞(Adipose derived stem cells, ADSCs)在外来生长因子的诱导下可分化为脂肪、骨、软骨、神经、肌源性细胞等多种组织细胞。利用ADSCs转化成骨并提高其成骨活性已成为国内外新的研究热点之一,具有良好的应用前景。在骨诱导因子研究中,主要集中在血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)和骨形成蛋白(Bone morphogenetic proteins, BMPs)的联合应用方面。BMPs是一组属于转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)超家族的细胞因子,在胚胎发育及成人诱导骨和软骨组织分化中扮演着重要的角色。VEGF是目前已知的在血管生成中是最重要的调节因子。其具有促进血管内皮细胞增生,诱导血管生成和促进骨愈合的作用。近年来,在促进骨缺损修复的各种动物模型中,联合应用VEGF和BMPs对骨再生和修复显示出累加和促进作用,且不同的BMPs与VEGF联合、不同的BMP/VEGF比例的控制对诱导成骨能力也存在差别。目前,对于BMPs与VEGF的联合应用诱导ADSCs成骨分化的研究较少。本研究主要目的如下：1.通过对hADSCs的培养及鉴定,验证该hADSCs是否具有成脂和成骨分化能力。2.选择三种不同的外源性重组人骨形成蛋白(recombinant human Bone morphogenetic proteins, rhBMPs)作用于hADSCs,对比测试这三种rhBMPs的体外诱导成骨分化能力,筛选出成骨分化能力较强的rhBMPs,为与重组人血管内皮生长因子(recombinant human Vascular endothelial growth factor, rhVEGF)的体外联合应用提供实验基础。3.将筛选出的rhBMPs与rhVEGF联合作用于hADSCs,研究rhBMPs与rhVEGF联合应用是否比单一应用更为有效,是否能够发挥最佳的诱导成骨能力,并摸索rhBMPs与rhVEGF联合的最佳配伍比例,为体内实验进而应用于临床有效治疗骨折不愈合和骨缺损奠定实验基础。材料与方法1.分别对hADSCs成脂及成骨诱导,21天时行Sudan IV和茜素红染色(Alizarin red Staining, ARS)。2.三种rhBMPs诱导hADSCs成骨分化。分为5组：BM组、OM组、BMP-2组、BMP-6组和BMP-9组。分别于成骨诱导第14天、21天和28天行ARS染色定量检测和RT-PCR,检测(?)ALP、OCN、ColI、BSP、Runx2、OSX、Dlx5和Msx2基因表达。3.优选的rhBMPs与rhVEGF联合诱导hADSCs成骨分化。分为12组：BM组、OM组、IngBMP-6组、10ngBMP-6组、0.1ngVEGF组、1ngVEGF组、10ngVEGF组、1ngBMP-6+0.1ngVEGF组、1ngBMP-6+1ngVEGF组、1ngBMP-6+10ngVEGF组、10ngBMP-6+1ngVEGF组和10ngBMP-6+10ngVEGF组。分别于成骨诱导第14天、21天和28天进行ARS染色定量检测(?)(?)RT-PCR,检测(?)ALP、OCN、Coll、BSP、Runx2、OSX、Dlx5和Msx2基因表达。结果1.成脂诱导21天,SudanⅣ染色BM组和10-4M地塞米松组可见大量红染脂滴。2.成骨诱导21天,ARS染色OM组可见大量红染钙结节。3.不同rhBMP诱导的hADSCs成骨分化研究：ARS染色：第14天BMP-9组与OM组相比,OD值明显升高(P<0.01)RT-PCR结果显示：第14天,BMP-9组OCN(P<0.05)、BSP和Runx2基因(P<0.01),BMP-6组OCN基因(P<0.01)；第21天,BMP-6组、BMP-9组OCN(P<0.01)、ColI和Runx2基因(P<0.05)；第28天,BMP-9组Runx2(P<0.05)、ALP和BSP基因(P<0.01),BMP2组ALP(P<0.01)和BSP基因(P<0.05)表达明显升高。4. rhVEGF调节rhBMP-6诱导的hADSCs成骨分化研究：ARS染色：第14天,1ngBMP-6组和10ngVEGF组(P<0.05)10ngBMP-6+1ngVEGF组(P<0.01),第28天,0.1ngVEGF组、1ngVEGF组和10ngVEGF组(P<0.01), 1ngBMP-6+0.1ngVEGF组、1ngBMP-6+10ngVEGF组(JP<0.05)OD值升高。组间相比,第14天,10ngBMP-6+1ngVEGF组与10ngBMP-6组和1ngVEGF组相比,OD值升高(P<0.01),第28天,1ngVEGF组与1ngBMP-6+1ngVEGF组和10ngBMP-6+1ngVEGF组相比,10ngVEGF组与10ngBMP-6+10ngVEGF组相比OD值升高(P<0.01)RT-PCR结果显示：与OM组相比,第14天1ngVEGF组ALP基因(P<0.01),1ngVEGF组、1ngBMP-6+1ngVEGF组和1ngBMP-6+10ngVEGF组(P<0.05)10ngVEGF组OCN基因(P<0.01),10ngVEGF组OSX和Msx2基因(P<0.05)表达升高。第21天,除BM组和OM组,其余各组ColI基因表达升高(P<0.01)组间相比,1ngBMP-6+1ngVEGF组与IngVEGF组相比ColI基因(P<0.05),1ngBMP-6+10ngVEGF组与1ngBMP-6组和10ngVEGF组相比ColI基因(P<0.01)和OSX基因(P<0.05)表达升高。结论1.体外培养和诱导的hADSCs具有成脂和成骨分化能力。2. hADSCs中加入成骨诱导剂及rhBMPs,对hADSCs具有成骨分化作用。3.通过基因表达测试,(?)ADSCs应答所有的rhBMPs,其中rhBMP-9和rhBMP-6成骨分化能力最好。4.在分子水平和细胞信号通路方面,rhVEGF和rhBMP-6联合应用可以有效促进hADSCs的诱导成骨分化,比单一使用rhVEGF或rhBMP-6更为有效,且rhBMPs/rhVEGF比例为1：10的成骨分化能力优于1：1或10：1。