[目的]通过建立体外幽门螺杆菌(H.pylori)感染人牙周膜成纤维细胞(hPDLFs)模型,观察不同浓度H.pylori对hPDLFs形态学、超微结构、细胞总蛋白、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)、Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ)等的影响,研究H.pylori感染时hPDLFs生物学变化,探讨H.pylori与牙周炎的相关性及其临床意义。[方法]1.利用选择性培养基对H.pylori(国际标准产毒株ATCC43504)进行体外培养及鉴定,调整H.pylori浓度分别为8×105cfu/ml、4×106cfu/ml、2×107cfu/ml、1×108cfu/ml。2.利用体外细胞培养技术,对hPDLFs进行体外培养及形态学鉴定,调整第5代细胞浓度为2×105个/ml。3.将4种浓度的H.pylori分别与2×105个/ml的hPDLFs共培养0-5天(d)(细菌:细胞=4:1、20:1、100:1、500:1),建立H.pylori感染hPDLFs体外模型,同时设立细胞空白对照组和细菌空白对照组。通过倒置显微镜分别观察其6h、12h、24h、48h时hPDLFs的细胞形态学变化;透射电镜(TEM)观察其48h时hPDLFs的细胞超微结构变化。并对体外模型4个时间节点(0d、1d、3d、5d),使用改良BCA法检测hPDLFs的细胞总蛋白;荧光实时定量PCR法(RT-PCR)和Western-blot法检测ALP、OCN、COL-Ⅰ基因表达和蛋白表达。采用SPSS13.0软件对以上结果进行统计分析。[结果]1.倒置显微镜观察显示:随着H.pylori菌液浓度的增大和培养时间的延长,hPDLFs细胞从贴壁的长梭形变为圆形,折光性减弱;贴壁细胞减少,悬浮细胞增多,并在周围出现大量细胞碎片。2.透射电镜观察显示:被H.pylori感染的hPDLFs细胞模型,细胞超微结构有不同程度破坏,呈现为:胞核不规则、核膜不完整、染色质部分凝固;细胞器破坏明显,结构不完整;线粒体肿胀肥大或透明变性,线粒体嵴破坏、甚至呈空泡状;粗面内质网膜结构破坏,有不同程度的脱颗粒现象。3.改良BCA法检测显示:H.pylori感染后第1d时,hPDLFs总蛋白量较细胞空白对照组增加,差异无统计学意义(P>0.05);第3d和第5d时,hPDLFs总蛋白量较细胞空白对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05),且随着H.pylori浓度的增加和培养时间的延长,总蛋白量降低越来越显著。4.RT-PCR和Western-blot法检测均显示:H.pylori感染后,hPDLFs的ALP、OCN、COL-Ⅰ基因表达和蛋白表达较细胞空白对照组均降低,差异有统计学意义(P<0.05),且随着H.pylori浓度的增加和培养时间的延长,差异越来越显著。[结论]1.在体外环境培养下,H.pylori对hPDLFs细胞形态学及细胞超微结构有明显影响,提示H.pylori对hPDLFs有细胞毒性作用。2.hPDLFs的总蛋白量受H.pylori浓度和作用时间的共同影响。在低浓度、短时间感染H.pylori后,hPDLFs呈现应激性分裂与增殖;在高浓度、长时间H.pylori作用下hPDLFs的分裂与增殖功能受到抑制。3.hPDLFs的胶原纤维合成能力和向成骨方向分化能力与H.pylori浓度和作用时间有显著相关关系。在一定浓度和一定时间共同作用下将影响hPDLFs正常功能的行使,高浓度、长时间H.pylori作用下,hPDLFs的胶原纤维合成和向成骨方向分化方面的生物学功能将受到抑制。