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目的:观察创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)后大鼠伤灶周围脑皮质区miRNA-9的表达变化规律并在细胞水平上探讨其在颅脑损伤后发挥的作用及分子机制。方法:对已发表的创伤性脑损伤后micro RNA芯片数据进行整合并重新分析,筛选出差异表达的基因miRNA-9,并应用生物信息学技术预测出其下游靶基因PTCH1;实验一:选取成年雄性SD大鼠60只建立控制性皮质撞击损伤模型(controlled cortical impact,CCI),并收集TBI后6 h,1、3、7、14、28d各时间点伤灶周围脑组织,应用Q-PCR法检测miRNA-9和PTCH1基因表达变化及应用Western blot法检测PTCH1蛋白及hedgehog信号通路蛋白SHH、Gli1蛋白的表达情况。实验二:提取并培养原代大鼠脑微血管内皮细胞,使用不同浓度的含依托泊苷的培养基进行处理,根据CCK-8结果选定最佳处理浓度;然后将内皮细胞依次分为对照组、损伤模型组[用依托泊苷(etoposide,ETO)损伤]、miRNA-9过表达损伤模型组、空转染损伤模型组,分别应用Q-PCR法验证miRNA-9转染效果、CCK-8法检测各组细胞活力及Western blot法检测各组细胞中B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(Bcl-2Associated X,Bax)、活化半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3蛋白(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3,cl-caspase-3)表达水平。实验三:提取并培养原代大鼠脑微血管内皮细胞,将内皮细胞依次分为对照组、miRNA-9抑制组(inhibitor组)和miRNA-9过表达组(mimic组),分别应用Western Blot法和明胶酶谱法检测各分组内皮细胞培养基中基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein,MMP-9)的表达量及生物活性,并应用划痕实验和Matrigel血管生成实验检测各组细胞迁移能力和成管能力。实验四:提取并培养原代大鼠脑微血管内皮细胞,先将内皮细胞依次分为对照组、miRNA-9过表达组(mimic)、损伤模型组(ETO)和miRNA-9过表达损伤模型组(ETO+mimic),检测不同组间PTCH1蛋白的表达变化;后将内皮细胞依次分为对照组、miRNA-9过表达组(mimic组)、miRNA-9过表达NF-κB干预组(mimic+QNZ)、NF-κB干预组(QNZ),检测各组细胞Gli1、NF-κB、MMP-9及VEGF的表达。结果:实验一:(1)Q-PCR结果显示:从伤后7d起,伤灶周围脑组织中miRNA-9表达开始增加(P<0.05),并于伤后14d达高峰(P<0.01),后表达降低且趋于正常水平;PTCH1 m RNA从伤后6h即开始大量表达(P<0.01),其表达量随着时间点的迁移逐渐降低,7d时已恢复正常水平;(2)Western Blot结果显示:PTCH1蛋白在伤后6h即开始大量表达(P<0.05),但在伤后3d时已趋于正常水平,其结果和Q-PCR结果较吻合;SHH蛋白在伤后随时间点迁移其表达趋势逐渐增加,于14d达高峰(P<0.05),后表达趋于正常水平;Gli1蛋白表达趋势和SHH蛋白相似,在伤后14d表达量达高峰(P<0.05),后逐渐降低并趋于正常水平。实验二:(1)CCK-8结果显示:最佳药物处理浓度为20μmol/L;(2)内皮细胞建模转染后,Q-PCR结果提示损伤模型组较对照组miRNA-9表达显著降低(P<0.01),但miRNA-9过表达损伤模型组miRNA-9表达显著高于损伤模型组(P<0.05);(3)CCK-8结果同样显示:miRNA-9过表达损伤模型组细胞活力明显高于损伤模型组(P<0.05);(4)Western Blot结果显示:相比于损伤模型组,miRNA-9过表达损伤模型组内皮细胞Bcl-2蛋白表达增加(P<0.05),Bcl-2/Bax值增加(P<0.05),但Bax蛋白、活化caspase-3蛋白表达降低(P<0.05)。实验三:(1)Western Blot结果显示:miRNA-9过表达组内皮细胞培养基中MMP-9蛋白表达较对照组显著增加(P<0.05);(2)明胶酶谱实验结果显示:miRNA-9过表达组内皮细胞培养基中MMP-9活性较对照组显著增加(P<0.05);(3)划痕实验结果显示:miRNA-9过表达组细胞迁移距离较对照组明显增加(P<0.05);(4)细胞成管实验结果同样显示:miRNA-9过表达组细胞成管数目较对照组明显增加(P<0.05)。实验四:(1)Western Blot结果显示:miRNA-9过表达组较对照组PTCH1蛋白表达显著降低(P<0.01),而损伤模型组与对照组相比PTCH1表达明显增高(P<0.05),但在损伤模型基础上过表达miRNA-9可显著降低PTCH1的表达(P<0.05);(2)Western Blot结果显示:与对照组相比,miRNA-9过表达组内皮细胞核内NF-κB蛋白、胞质内Gli1蛋白、MMP-9蛋白和VEGF蛋白表达显著升高(P<0.05),但给予NF-κB抑制剂QNZ之后可以逆转miRNA-9过表达的效应,促使NF-κB、MMP-9及VEGF蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论:创伤性脑损伤恢复期伤灶周围脑组织中miRNA-9表达增多,且过表达miRNA-9可通过激活Hedgehog信号通路上调核内NF-κb蛋白表达水平促进MMP-9及VEGF的表达提高内皮细胞活力、促进内皮细胞迁移和管腔形成,提示TBI后miRNA-9的表达增多有助于脑血管重塑的发生,促进神经功能恢复。