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子痫前期(preeclampsia,PE)是妊娠期特有的疾病之一,在妊娠20周后出现收缩压>140 mm Hg和(或)舒张压>90 mm Hg伴蛋白尿>0.3 g/24 h,或随机尿蛋白+,是导致母婴发病和死亡的主要原因。目前,PE的发病机制尚不清楚,但胎盘一旦娩出,子痫前期的症状就会减轻甚至消失,所以提示在子痫前期的发病中胎盘起至关重要的作用。胎盘主要由滋养细胞构成,研究显示,胎盘滋养细胞侵袭不足可引起胎盘着床过浅,进而影响胎盘发育,最终导致子痫前期等妊娠期疾病的发生。microRNAs(miRNAs)是一类内源性非编码单链小分子RNA,长度约为22个核苷酸,可通过调控靶m RNA在生物活动中发挥重要作用。近年来越来越多的研究显示,miRNAs在人类的胎盘组织中的表达可影响滋养细胞的侵袭、增殖和蛋白质合成等功能;在PE发生时,一些miRNAs出现异常表达,miR-34a就是其中之一,Sun M的研究表明,miR-34a在PE的胎盘组织中显著升高,而且miR-34a与滋养细胞侵袭、迁移等功能密切相关。在乳腺癌中,miR-34a可以靶向调控Notch1来影响细胞的侵袭和增殖。然而,在PE中miR-34a与Notch1是否具有相关性及如何调控滋养细胞的生物学功能尚未见报道。目的以胎盘组织和人绒毛膜滋养层细胞系JEG-3细胞为研究对象,探讨Micro RNA-34a(miR-34a)通过调节Notch1对JEG-3细胞侵袭和增殖能力的影响,而了解miR-34a参与子痫前期发生发展的分子机制。材料和方法1实验材料本研究选用胎盘组织和人绒毛膜滋养层细胞系JEG-3细胞为研究对象。本实验经本院伦理委员会批准,胎盘收集与实验的所有程序都是严格执行的,标本提供者均知情同意。选取2016年9月到2017年3月在郑州大学第三附属医院进行分娩的60例孕妇,其中正常对照(N)组孕妇30例,PE组孕妇30例,PE的诊断标准参考第8版《妇产科学》。JEG-3细胞株购买自北京鼎国昌盛生物科技有限公司,该细胞的生物学性状与原代分离的滋养细胞很接近。2方法收集正常对照组和子痫前期组孕妇胎盘组织,采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法检测各组miR-34a和Notch1 m RNA的表达;利用免疫组化法检测各组Notch1蛋白的定位和表达。并设计miR-34a mimics、miR-34a inhibitor和Notch1 si RNA,对JEG-3细胞进行转染,采用Real-time PCR法检测各组miR-34a和Notch1 m RNA的表达;利用Western blot检测各组Notch1蛋白的表达;通过Transwell侵袭实验、划痕实验,观察转染后细胞的侵袭和迁移能力的变化;采用CCK8检测转染前后细胞存活情况。3统计学处理本研究中所得数据均用SPSS21.0软件进行统计学分析,数据以?x±s表示,两组间数据分析时采用独立样本t检验或卡方检验(χ2),多组数据分析时采用单因素方差分析。以α=0.05作为检验标准。结果1两组孕妇一般临床资料和检测指标的比较1.1两组孕妇一般临床资料的比较正常对照组和子痫前期组孕妇的平均年龄分别是(29.25±2.45)岁和(30.63±3.51)岁,分娩时平均孕周是(37.06±1.62)周和(34.38±2.32)周,收缩压分别是(112.48±3.76)mm Hg和(170.14±4.69)mm Hg,舒张压分别是(69.32±3.67)mm Hg和(115.31±4.58)mm Hg,蛋白尿分别是(0)g/24h和(5.67±3.25)g/24h,胎儿体重分别为(3504.05±436.31)g和(3025.62±629.05)g。两组间孕妇的年龄相比较,差异无统计学意义(P>0.05);子痫前期组收缩压、舒张压和蛋白尿均高于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);子痫前期组孕妇的孕周和新生儿体重低于正常对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。1.2两组孕妇胎盘组织中miR-34a miRNA和Notch1 m RNA的表达水平子痫前期组miR-34a miRNA的表达水平(1.84±0.26)显著高于正常对照组(1.02±0.22),差异具有统计学意义(P<0.05);子痫前期组Notch1 m RNA的表达水平(0.63±0.13)明显低于N组(1.01±0.16),差异具有统计学意义(P<0.05)。1.3两组孕妇胎盘组织中Notch1蛋白的定位和表达强度两组胎盘组织的滋养细胞和血管内皮细胞均可检测到Notch1蛋白的表达,Notch1蛋白在子痫前期组的表达强度明显低于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。2转染miR-34a对JEG-3细胞中Notch1 m RNA和蛋白的影响与空白对照组(1.00,1.37±0.09)和转染试剂组(0.94±0.14,1.31±0.09)和NC组(0.89±0.13,1.34±0.10)相比,miR-34a mimics组(0.46±0.08,0.52±0.08)Notch1 m RNA和蛋白的表达水平均明显降低(P<0.05)。与空白对照组(1.00,1.04±0.08)和转染试剂组(0.94±0.14,1.00±0.08)和inhibitor NC组(0.90±0.13,1.04±0.07)相比,miR-34a inhibitor组(1.42±0.12,1.86±0.11)中Notch1 m RNA和蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05)。3转染miR-34a对JEG-3细胞侵袭、迁移和增殖能力的影响Transwell侵袭实验和划痕实验的结果显示,miR-34a mimics组(78.38±6.26,22.82±2.57)与空白对照组(120.88±8.20,49.62±3.81)、转染试剂组(113.51±8.62,47.63±4.02)和NC组(114.13±5.64,52.09±5.79)相比,JEG-3细胞的侵袭能力明显降低(P<0.05),细胞的迁移能力显著下降(P<0.05);CCK8的结果显示,在三个时间点细胞的增殖受到抑制(P<0.05)。然而miR-34a inhibitor组(162.88±7.61,62.46±3.76)的JEG-3细胞的侵袭细胞数和迁移距离均明显增加(P<0.05);CCK8的结果显示,在三个时间点细胞的增殖率显著增加(P<0.05)。4沉默Notch1对JEG-3细胞Notch1 m RNA和蛋白的影响与空白对照组(1.00,1.39±0.05)和转染试剂组(0.94±0.14,1.35±0.11)和si-NC组(0.91±0.10,1.32±0.15)相比,Notch1 si RNA组(0.40±0.32,0.46±0.08)Notch1 m RNA和蛋白的表达水平均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。5沉默Notch1对JEG-3细胞侵袭、迁移和增殖能力的影响Transwell侵袭实验和划痕实验的结果显示,Notch1 si RNA组(82.00±7.11,23.21±2.59)与空白对照组(120.88±8.20,49.62±3.81)、转染试剂组(113.51±8.62,47.63±4.02)和si-NC组(112.63±8.58,46.08±6.18)相比,JEG-3细胞的侵袭能力明显降低(P<0.05),细胞的迁移能力显著下降(P<0.05);CCK8的结果显示,在三个时间点细胞的增殖受到抑制(P<0.05)。结论miR-34a影响滋养细胞的侵袭和增殖能力,并可能是通过抑制Notch1的表达发挥作用,参与了子痫前期的发生发展。