【摘 要】
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猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）主要危害哺乳仔猪,患病仔猪临床表现为呕吐、急性腹泻、脱水和高死亡率。在我国,猪流行性腹泻疫情形势严重,给养猪业造成巨大经济损失。新生仔猪通过母乳获取乳源性免疫是目前抵抗PEDV侵袭的最有效方法,其中起保护作用的主要是分泌型免疫球蛋白A（s IgA）抗体。因此,母乳中PEDV s IgA水平是评估免疫状态和制
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猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）主要危害哺乳仔猪,患病仔猪临床表现为呕吐、急性腹泻、脱水和高死亡率。在我国,猪流行性腹泻疫情形势严重,给养猪业造成巨大经济损失。新生仔猪通过母乳获取乳源性免疫是目前抵抗PEDV侵袭的最有效方法,其中起保护作用的主要是分泌型免疫球蛋白A（s IgA）抗体。因此,母乳中PEDV s IgA水平是评估免疫状态和制订防控方案的重要指标。猪流行性腹泻病毒的S蛋白是主要的免疫原性蛋白,在诱导PEDV中和抗体方面起着关键作用。COE区域是S蛋白上的核心中和抗原表位,具有较好的反应原性。本研究表达纯化了可溶性重组蛋白GST-COE,将重组蛋白作为抗原包被酶标板,建立间接ELISA（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）方法检测疫苗免疫母猪乳汁和血清中IgA抗体水平,经试验该方法具有较好的特异性和灵敏性。以病毒中和试验为参照,验证本研究建立的间接ELISA检测方法所检阳性样本含PEDV特异性中和抗体,说明所建方法可应用于临床检测。具体内容如下:1.PEDV重组蛋白GST-COE的表达与纯化根据猪流行性腹泻病毒AJ1102毒株基因序列设计一对PCR扩增引物,扩增COE目的片段,并将其克隆至原核表达载体p GEX-KG,成功构建了重组质粒p GEX-KG-COE,将重组质粒转化至BL21（DE3）感受态,诱导表达可溶性蛋白GST-COE,经SDS-PAGE、Western blot验证,该重组蛋白为目的蛋白。2.间接ELISA检测方法的建立原核表达可溶性蛋白GST-COE经亲和层析纯化作为包被抗原建立间接ELISA检测方法,优化各个反应条件,最终确定该方法最佳检测条件:乳清检测中最佳抗原包被浓度为3.125 ug/m L、乳清最佳稀释倍数为1:10、最佳一抗作用条件为37℃孵育60 min、最佳封闭液选择5%BSA、最佳封闭条件为37℃作用150 min、酶标二抗最佳稀释倍数为1:20000、酶标二抗最佳作用条件为37℃孵育45 min、最佳底物显色时间为避光显色10 min;血清检测中最佳抗原包被浓度为6.25 ug/m L、血清最佳稀释倍数为1:10、一抗作用条件为37℃孵育45 min、最佳封闭液选择5%BSA、最佳封闭条件为37℃作用120min、酶标二抗最佳稀释倍数为1:20000、酶标二抗最佳作用条件为37℃孵育45 min、最佳底物显色时间为避光显色10 min。乳清和血清样品检测共用一个判定标准:待检样品OD450＞0.295时,判定为阳性;当被检样品的OD450＜0.248时,判定为阴性,当检测结果介于两者之间时判定为可疑。3.间接ELISA检测方法特异性、敏感性和重复性的验证用自建方法分别检测口蹄疫病毒（FMDV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗体阳性血清进行检测,没有发生交叉反应,说明该方法特异性较好。对该方法的敏感性进行检验,阳性乳清、血清各4份分别稀释至1:1280时,其OD450值仍都高于阳性临界值,结果表明该方法具有较好的敏感性。对该方法的重复性进行检验时,其批间重复变异系数和批内重复变异系数均小于10%,说明该方法重复性较好。4.间接ELISA检测方法的应用用本方法和商品化试剂盒同时检测临床乳清25份、血清50份,符合率达到100%,说明该方法可用于临床诊断。用建立的间接ELISA检测方法检测63份PEDV抗体阳性血清,分别测定血清中PEDV特异性抗体IgG和IgA,发现血清中IgA和IgG抗体水平呈现很好的正相关。结合有关报道,乳汁中PEDV IgA抗体水平与血清中PEDV IgG和IgA抗体水平呈正相关,故在乳汁采集困难的情况下,可通过检测血清PEDV IgG和IgA抗体评估乳汁中IgA抗体水平。
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