谷氨酰胺转氨酶(TGase)被广泛应用于蛋白质的修饰,可以改变蛋白质网络结构、增强保水能力和促进凝胶形成,甚至提高蛋白质营养价值,在食品、医药、纺织等领域具有重要的应用价值。目前,TGase的主要来源是微生物,因为微生物生长快,产量大,效率高。天然发酵菌种可以直接获得活性TGase,但发酵周期长、工艺复杂且成本高。而异源重组表达工艺简单、成本低、周期短。巴斯德毕赤酵母研究背景清楚,是一种理想的异源蛋白表达系统,因此,选择毕赤酵母异源表达谷氨酰胺转氨酶是一个可行的策略。本研究将前期筛选得到的吸水链霉菌107.3的谷氨酰胺转氨酶基因在毕赤酵母GS115中进行表达、超滤纯化和酶学性质表征探究,通过响应面法优化重组菌株发酵条件,并在10 L发酵罐小试表达重组酶,评价重组菌株的发酵性能。主要研究结果如下:(1)成功构建了谷氨酰胺转氨酶的分泌载体并在毕赤酵母GS115中实现表达。构建含有吸水链霉菌前肽pro、kex2酶切位点、成熟酶mTGase三部分融合基因的分泌载体pPIC9K-pro-kex-TGase并通过电转整合到毕赤酵母GS115的基因组中,获得阳性克隆转化子GS115/pPIC9K-pro-kex-TGase(hs-D6),经表达可直接获得活性重组谷氨酰胺转氨酶,在dispaseⅡ处理后重组酶酶活力达到0.3 14 U/mL。SDS-PAGE分析发现,重组毕赤酵母hs-D6菌株可表达出45 kDa左右大小的蛋白条带,与酶原理论分子大小一致,不存在糖基化。但未见成熟酶mTGase蛋白条带,可能原因是GS115菌株自身的kex2蛋白酶识别kex2位点,酶切了一小部分表达的TGase酶原。因此,本研究构建的重组吸水链霉菌TGase的毕赤酵母表达系统,既可以产生大量酶原蛋白,又可以直接产生具有酶活性的mTGase,这在一定程度上实现了我们的设计目标即直接获得活性TGase,为谷氨酰胺转氨酶的生产和分子改造提供了新思路。(2)超滤纯化重组谷氨酰胺转氨酶并对其酶学性质进行表征。利用超滤的方法可以实现重组酶的简单纯化,10 kDa规格的超滤管可以完全截留重组酶蛋白;使用纯化后的重组谷氨酰胺转氨酶进行酶学性质的测定,其最适温度为40℃,最适pH为7,在最适条件下测定重组酶最大速度(Vmax)和动力学常数(Km)分别为16.58μmol/(L·min)、3.79μmol/L;Na+、K+对酶活有一定的促进作用,Ca2+几乎没有影响,Mg2+、Mn2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+均对重组 TGase 表现出抑制作用,且 Fe2+、Zn2+、Cu2+离子对酶活的抑制作用随着浓度的增加而增强;体积分数10%的甲醇、乙醇对重组TGase有一定积极的促进作用,甘油对酶活性影响较小,丙酮、异丙醇均对酶活性有抑制作用,尤其是丙酮有明显的抑制作用;表面活性剂中SDS对重组TGase具有明显的抑制作用,PEG800、PEG8000、Tween20均对重组TGase酶活性具有一定的促进作用。不同来源的谷氨酰胺转氨酶在酶特性上也存在着差异,研究其酶学性质对酶的实际生产应用具有重要意义。(3)响应面法优化谷氨酰胺转氨酶的发酵条件,在10L发酵罐中进行发酵小试。采用Plackett-Burman(PB)设计和响应面法(RSM)在摇瓶水平研究了接种量、诱导温度、时间、初始pH值和甲醇浓度的5个发酵条件,得到了重组毕赤酵母hs-D6菌株在摇瓶中的最佳产酶条件为:接种量OD600为6、pH为7、甲醇浓度2.0%、诱导温度23℃、诱导时间72h。优化发酵条件后,重组菌株在摇瓶中产TGase酶活力可达1.1 U/mL,是初始酶活的3.6倍。采用响应面摇瓶优化的发酵条件结果,在10 L发酵罐中进行扩大培养发酵表达重组酶,结果表明在优化条件下重组菌株产谷氨酰胺转氨酶的酶活力进一步提高,不仅可以积累重组菌株较大的生物量,还具有比较好的产酶效果;在高生物量、诱导pH5.0的条件下重组酶活力最高达到2.54 U/mL,积累生物量达到30g/L,是初始酶活的8.5倍。说明重组毕赤酵母hs-D6在摇瓶和发酵罐的优化条件下具有较好的发酵性能。