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棉花是世界上最重要的天然纤维来源之一,在纺织业中具有重要作用,同时还是纤维素合成以及细胞伸长研究的模式植物。棉纤维是从胚珠表皮上分化和突起的单细胞,与拟南芥表皮毛具有很大的相似性,后者可以作为棉纤维研究的模式。棉纤维包括长绒(lint)和短绒(fuzz),前者在开花当天从棉花胚珠外珠被表皮层分化突起,后者在开花后4-5天时从外珠被表皮上突起。microRNA (miRNA)是真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码小分子RNA,通过碱基互补配对的方式识别靶标mRNA,通过靶基因切割或翻译抑制的方式调控靶基因表达。miRNA在植物生长发育各个方面和生物非生物胁迫抗性调节中发挥重要的作用。本研究利用高通量测序方法测序3个纤维起始发育突变体(XZ142FLM, MD17FLM和SL1-7-1FLM),2个短绒起始发育突变体(N1NSM和n2NSM)和正常纤维TM-1六个材料棉纤维起始发育期的小RNA,利用雷蒙德氏棉和陆地棉基因组序列鉴定棉花MIRNA前体,用Northern blotting验证新miRNA在棉花中的表达；根据miRNA在野生型和突变体中的表达差异鉴定棉纤维起始调控的关键miRNA;用转录组数字表达谱验证miRNA靶基因的表达；利用5’RACE验证miRNA对靶基因mRNA的剪切。研究结果如下：1.陆地棉胚珠早期发育过程中miRNA的鉴定以陆地棉遗传标准系TM-1为研究材料,建立了棉花纤维起始发育时期和短绒起始发育时期的小RNA混库,TM-LA(-3,-1,0,1DPA)和TM-LB (-1,0,1,3,5DPA)。利用HiSeq测序技术共检测到了三千万条小RNA序列,共检测到33个已知miRNA家族表达。利用雷蒙德氏棉基因组序列,成功鉴定出了93个新的MIRNAs前体,包括28个已知miRNA家族的新成员,它们属于10个家族；另外65为全新的miRNA,它们可以产生43个不同成熟体,将其编号为miR7234-miR7276。Northern blotting验证发现miR7235,miR7244和miR7251在-3DPA和3DPA的胚珠中的表达量相同,与测序结果一致。miR7235可以靶向肌动蛋白ATP酶超家族蛋白基因,它可以介导该家族基因Gra#S24823914和Ghi#S42313172mRNA的切割,切点位于miRNA与mRNA的互补区域miR7235第10和第11个碱基之间。2.陆地棉基因组序列在microRNA鉴定中的应用以三个纤维起始发育突变体为材料,建立了棉花纤维起始发育时期(-3,-1,0,1DPA)的小RNA混库；以短绒起始发育突变体为材料,构建短绒起始发育时期(-1,0,1,3,5DPA)的小RNA混库；结合野生型小RNA混库(TM-LA和TM-LB),共七个库,每个库的小RNAs序列超过了16M。利用陆地棉基因组组装序列鉴定出322个新的棉花MIRNAs前体。这些前体的长度变化很大,从79nt到544nt不等,主要集中在80-200nt,平均长度是149.8nt。它们所形成的miRNA成熟体中,74.2%第一个碱基是“尿嘧啶”。这322条MIRNAs中,197个前体属于38个已知家族；剩余125条不与miRBase库(Release20)中任何miRNA同源,为新的miRNA.这125个新miRNA前体可以产生102条不同的miRNA成熟体,归类于86个新的miRNA家族,将其命名为ghr-miRn01-86。58条新MIRNAs前体获得的成熟体序列存在一定变异,包括长度的变异和位置变异。同一家族中不同成熟体序列的差异主要是成熟体5’端和3’端起止位置存在差异和碱基的变异,它们的表达差异非常大。以miR156/535家族成员为例证明了成熟体序列差异对于靶基因的选择和靶基因mRNA的切割位点造成影响。3.棉花miRNA在纤维起始发育过程中功能分析利用七个棉纤维起始时期小RNA库鉴定这148个miRNA家族在野生型和突变体中的表达。在野生型TM-1中下调而在突变体中共同上调表达的miRNA,包括miRl56,miR160, miR160*, miR166, miR167, miR171,miR535, miR827等保守家族,miR2948*, miR3476, miR7495, miR7504, miR7505, miR7508等非保守家族,以及miRn13, miRn21, miRn51, miRn60, miRn77, miRn80等七个新家族。在野生型TM-1中上调表达而在突变体中共同下调表达的miRNA,包括miR162, miR164, miR166*, miR172, miR396*, miR403, miR482*等保守家族,miR2949, miR7122, miR7502, miR7511四个非保守家族,以及新家族的miRn08和miRn81。野生型TM-1与突变体比较,在三个纤维起始突变体中共同上调表达而在两个短绒起始突变体中共同下调表达的miRNA,包括miR169, miR172*, miR390, miR390*, miR394, miR396, miR482等保守家族,非保守家族的miR2948,以及新鉴定家族的miRn07, miRn76, miRn85, miRn85*。用六种实验材料-3,-1,1,3和5DPA胚珠的转录组表达谱验证miRNA靶基因的表达,发现差异表达的39个miRNA家族的靶基因有237个。经过对靶基因的表达模式分析,鉴定出73个基因可能受对应的miRNA调控。用5’RACE验证了8个miRNA对11个靶基因的剪切。结果显示miR164, miR171, miR394和miR396介导7个基因mRNA剪切的切点位于miRNA的第10和第11个碱基之间；miR397, miR530和miRn20介导的靶基因切割位点位于mRNA和miRNA结合区域上游6-10nt的位置；miRn80的靶基因Chi#S28642014的切割位点位于结合区域的下游80nt处。切点位置偏离miRNA的第10和第11个碱基之间的mRNA切割事件是由其他小RNA切割导致。