论文部分内容阅读
目的:以人中性粒细胞弹性蛋白酶（Human neutrophil elastase,HNE）作为刺激物刺激气道上皮细胞，在其形成的气道黏液高分泌模型中，探索番茄红素对病理型黏蛋白（Mucin，MUC）5ac的治疗效果及具体信号通路的相关研究。方法：将人支气管上皮细胞株HBE16细胞进行培养后，将其分成7组，分别进行如下处理，每组依次添加入浓度为0、25、50、75、100、200、400umol/L的番茄红素，经四甲基偶氮唑蓝光吸收法（Methylthiazolyl tetrazolium，MTT）观察各组HBE16细胞的存活率，根据细胞存活率确定番茄红素处理浓度。将HBE16细胞分成如下5组，予以番茄红素及表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）抑制剂AG1478进行干预：①对照组；②HNE处理组（50nmol/L）；③HNE（50nmol/L）+番茄红素（100umol/L）处理组；④HNE（50nmol/L）+AG1478（5umol/L）处理组；⑤HNE（50nmol/L）+番茄红素（100umol/L）+AG1478（5umol/L）处理组。采用逆转录聚合酶链式反应（Reverse transcription-PCR，RT-PCR）方法检测各组细胞中MUC5ac mRNA及EGFR mRNA的表达情况；以酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测各组细胞中MUC5ac蛋白的分布情况，并运用细胞免疫激光共聚焦显微镜进一步观察HNE16细胞经番茄红素作用前后各组细胞MUC5ac蛋白分布的差异情况；运用Western Blot方法测得各组细胞中EGFR和p-EGFR蛋白的表达情况。结果：从MTT实验结果中看出，番茄红素对HBE16细胞的抑制作用呈浓度依赖性，在番茄红素浓度不大于100umol/L时，细胞未见明显损伤，但当番茄红素浓度大于100umol/L时，随着番茄红素浓度升高，细胞贴壁比例明显上升，凋亡细胞显著增多；从上述可知给予番茄红素处理细胞浓度为100umol/L。HNE处理组中MUC5ac的mRNA和蛋白的吸光度面积积分值与对照组相比，有显著升高，由激光共聚焦显像观察的MUC5ac蛋白结果也提示其较对照组有显著增多，EGFR mRNA、EGFR蛋白及P-EGFR蛋白表达均明显升高。HNE+番茄红素处理组中MUC5ac mRNA及蛋白、EGFR mRNA及蛋白、P-EGFR蛋白较HNE处理组均明显降低，由激光共聚焦显像观察MUC5ac蛋白亦提示其表达有所下调；而HNE+番茄红素+AG1478组与HNE+AG1478处理组相对比，MUC5ac mRNA及蛋白、EGFR mRNA及蛋白、P-EGFR蛋白各组指标下调作用更明显。以上结果均经统计学方法检测差异均有统计学意义(P＜0.01)。结论：番茄红素可以通过减少EGFR本身生成并且阻断EGFR信号转导途径，从而发挥对气道黏液高分泌的抑制作用。本实验同时也为番茄红素针对慢性炎症性气道黏液高分泌相关疾病的治疗作用提出可行性。