肝脏是人体新陈代谢和药物转化的重要器官,基于肝细胞的体外培养细胞微系统或生物人工肝在医疗领域和药物筛选平台构建方面具有重要的研究意义和实用价值。细胞体外培养的核心目标在于保持其近似于体内状态的活度与功能,在体肝细胞作为一种高度特化的极性细胞,其细胞之间的紧密连接将肝细胞顶端膜和基底侧膜隔开,同时维持了肝细胞的“立方”(cuboidal)形态特征,而这种形态特征与肝细胞的功能表型维持密切相关。因此,以何种结构基底设计实现肝细胞极性或形态特征的维持是有关细胞平台构建的核心问题之一。此外,肝细胞体外培养微系统的检验与应用在于细胞活力和功能表型评价,较为直接的方法是采用分子生物学技术对蛋白、基因表达或代谢产物的检测分析,而相关方法通常不适于快速检测以及对待测样品的实时监测,特别是在一些体积小,设计复杂的细胞微系统或微流控芯片中,难以获得足够的检测样本以供相应的分子生物学技术分析。设计合理、有效的可视化细胞生长状态分析方法将有助于弥补这些缺陷,并能够成为细胞微系统在药物筛选等领域的参考指标。本研究基于以亚细胞尺度图式化结构支撑HepG2细胞“立方”形态的设计思路,依据肝细胞尺寸特征构建了微柱直径为4、10μm,微柱间距为4、7μm,微柱高度为4μm的4种微柱阵列图式化结构;基于以多细胞尺度图式化结构实现HepG2细胞聚集体培养而维持细胞连接和极性的设计思路,依据HepG2聚集体尺寸特征构建了内径100μm,深度100μm,无通道和含20μm、40μm通道的3种凹形图式化结构。在此基础上,考察了图式化结构尺寸设计对HepG2细胞生物学行为的影响。本文改进了基于TMRM(tetramethylrhodamine methyl ester)电势荧光染料的细胞静息膜电位(resting membrane potential,RMP)检测方法,提高了其准确性和适用性,并以之评价了图式化结构中HepG2细胞RMP与生长状态和极性的关系,提出以该方法分析体外微系统中细胞状态的可行性。相关实验结果有助于丰富细胞力学响应、电生理响应的相关知识,并对于生物人工肝或体外细胞微系统的设计、构建及评价分析具有一定的参考意义。本文的主要内容和结果:建立亚细胞尺度微柱阵列图式化结构,该结构上微柱面积覆盖率(percentage of pillared area,PPA)及微柱直径和间距尺寸影响HepG2细胞的形态发生以及粘着斑和细胞骨架装配,HepG2细胞功能基因表达与细胞形态学特征密切相关。具体表现为:PPA和微柱直径较大的结构上易于形成“立方”细胞,其白蛋白和CYP(cytochrome P450)表达均较高;微柱直径较小,间距较大(PPA较小)的结构上易于形成与平面基底相似的“扁平”状细胞,功能基因表达较低;微柱直径、间距均较小的结构上易于形成“梭形”细胞,伴随CYP基因的高表达。细胞增殖活力与微柱阵列图式化结构设计无显著关系,粘着斑的数量和面积与PPA成负相关趋势。提示合理的亚细胞尺度图式化结构有助于细胞形态的维持和功能表型的改善。构建多细胞尺度的凹形图式化结构,在上面HepG2细胞成聚集体方式生长,其白蛋白和CYP基因表达较常态二维培养显著提高。微小凹之间含通道的图式化结构较无通道组HepG2细胞功能基因表达无显著性差异,但通道设计有助于减少细胞凋亡。凹形图式化结构中细胞增殖活力随培养时间增长而降低,与通道设计无显著相关性。对上述两类图式化结构中HepG2细胞EMT(epithelial-mesenchymal transition)行为研究发现,凹形图式化结构上或其它结构上成聚集体状态的细胞E-钙黏素集中分布于细胞边缘,平面基底或微柱阵列图式化结构上的铺展细胞E-钙黏素分布较弥散,提示后者具有不同程度的EMT倾向,进一步检测EMT相关特征基因(α-SMA,vimentin,E-cadherin)的表达发现,两类图式化结构和平面基底上细胞相关基因表达均无明显差异。暗示HepG2细胞在本研究中的培养条件下未发生完全的EMT行为。以激光共聚焦显微镜对细胞外溶液和细胞内TMRM进行层扫分析,发现聚焦层面TMRM荧光强度会受到相邻层面的干扰,并依此改进了TMRM荧光强度取值方法;依据细胞内外离子分布特性建立了不依赖于“零电位”的细胞内TMRM非电势依赖结合测算方法。以TMRM测算细胞RMP方法的改进不仅提高了检测精度,也使之适用于三维培养细胞RMP的检测。已上述方法测算了不同图式化结构上HepG2细胞RMP,发现微柱阵列图式化结构上细胞RMP与平面基底无显著性差异;凹形图式化结构中HepG2细胞RMP显著低于平面基底。对凹形图示化结构细胞RMP频度分析发现,去极化(RMP>-20 mV)细胞比例与处于S期细胞比例有一定相关关系,提示以RMP评价细胞HepG2细胞生长状态和增殖活力具有一定可行性。