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目的:
神经管畸形(Neural tube defects,NTDs)是常见的严重出生缺陷,是由于神经管闭合异常所致,主要包括无脑、脑膨出和脊柱裂等,其病因及发病机制不清楚。目前研究认为是胚胎发育过程中多种基因调控异常和环境有害因素共同作用的结果。由于畸形改变严重,目前尚无良好的治疗方法。然而,干细胞移植技术的出现打破了中枢神经系统的神经细胞不能再生的禁锢,为神经系统疾病的治疗带来生机和希望。其中,骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)作为一种成体干细胞,不仅具有向中胚层间质细胞分化的能力,在一定条件或微环境中还可向外胚层或内胚层细胞分化,并可能对脊髓损伤、脑外伤、脑变性疾病、脑缺血、神经系统发育异常等疾病的神经功能缺损有治疗作用,被广泛应用于细胞移植、基因治疗和组织工程方面的研究。因此,MSCs可以作为组织工程较理想的种子细胞来源,MSCs移植治疗先天性脊椎裂可望成为治疗神经系统先天发育畸形最有前途的方法之一。
血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)和血小板源性生长因子-A(platelet-derived growth factor-A,PDGF-A)与脑部肿瘤、脑血管病和神经系统先天发育畸形等多种神经系统疾病的发生相关,在体内可产生一系列的生物学效应,如细胞分化、趋化和凋亡等,已经成为神经领域的研究热点。
本实验采用维甲酸致畸建立先天性脊柱裂胎鼠模型,结合胎仔外科,显微外科和显微注射等技术进行骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植,观察MSCs对显性脊柱裂胎鼠脊髓中VEGF-A和PDGF-A的表达变化规律影响,证实移植MSCs对显性脊柱裂胎鼠的治疗作用。
方法:
1、建立先天性脊椎裂胎鼠动物模型:将孕10天大鼠按135mg/Kg体重灌胃法给予4%维甲酸,制作先天性脊椎裂动物模型。
2、原代培养MSCs及腺病毒-GFP转染:无菌条件下取大鼠骨髓MSCs,用全骨髓贴壁培养法进行原代培养,腺病毒-EGFP(MOI值300-500)转染MSCs。
3、干细胞移植:利用胎仔外科方法将转染GFP的MSCs在孕16天经纤细玻璃针注射到先天性脊椎裂胎鼠的脊髓中,并存活至20天,剖宫取胎。
4、Real-time PCR法检测各组VEGF-A和PDGF-A mRNA表达情况:将同一孕鼠的胎鼠分为给药无畸形组、脊柱裂畸形组、给药无畸形MSCs移植组,脊柱裂MSCs移植组和脊柱裂空白移植组五组,分别应用Real-Time PCR技术进行VEGF-A和PDGF-A mRNA表达的检测。
5、统计学分析:采用SPSS17.0统计学软件进行分析,两组间比较应用t检验,多组问比较采用one-way ANOVA分析,以P<0.05表示有显著性差异。
结果:
1、移植后孕鼠和胎鼠的存活情况;
被移植孕鼠共20只,2只孕鼠16天移植后死亡,孕鼠存活率90%,存活并得到胎鼠标本共45只,其中给药无畸形胎鼠9只、脊柱裂畸形胎鼠10只、给药无畸形MSCs移植胎鼠9只,脊柱裂畸形MSCs移植胎鼠10只和畸形空白移植胎鼠7只。
2、通过Real-Time PCR技术检测各组VEGF-A和PDGF-A mRNA表达情况;
(1)脊柱裂畸形组VEGF-A和PDGF-A mRNA表达水平明显低于给药无畸形组,且有统计学意义,说明VEGF-A和PDGF-A在显性脊柱裂畸形组表达明显下调。
(2)脊柱裂畸形MSCs移植组VEGF-A和PDGF-A mRNA表达水平明显高于畸形组和畸形空白移植组,且有统计学意义,说明通过MSCs移植治疗后VEGF-A和PDGF-A表达上调。
(3)给药无畸形MSCs移植组VEGF-A和PDGF-A mRNA表达水平与给药无畸形组比较无明显差异,无统计学意义,说明通过MSCs移植对无畸形胎鼠无明显治疗作用。
结论:
1、先天性脊柱裂畸形的发生可能与VEGF-A和PDGF-A mRNA表达水平降低有关。
2、先天性脊柱裂畸形MSCs移植后可以通过上调VEGF-A和PDGF-A的表达而达到治疗作用。