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5-羟色胺(5-HT)作为体内重要的血管活性物质和神经系统的重要递质,是一种高度保守的生物胺,在哺乳动物中广泛参与机体各种机能活动的调节和病理过程,如食欲调节、脂肪代谢、糖代谢、胆汁酸代谢、免疫调节、肠道蠕动和肠道菌群改变。家禽脂肪代谢与哺乳动物有较大差异。本研究从动物和细胞两种模型来探讨鸡5-HT的功能、合成以及影响其合成的因素,初步阐明了鸡5-HT参与机体脂肪代谢的途径。(1)肉鸡5-HT受体的基因表达。选取正常饲养的肉鸡研究了5-HT受体在不同生长阶段(21 d和35 d)和不同组织器官(腹脂、下丘脑、肝脏、胸肌、腿肌、脾脏、胸腺、法氏囊、十二指肠、空肠和盲肠)的表达。试验结果显示,5-HT受体5-HT2A在腹脂组织中表达量最高,其次是在下丘脑、腿肌、脾脏、肝脏和胸肌,在空肠、十二指肠、回肠、胸腺和法氏囊表达量最低。5-HT在不同组织中的相对表达水平在21d和35d结果相似,提示肉鸡不同生长阶段不影响其表达结果。结果提示,在肉鸡体内5-HT可能参与脂肪代谢调控。(2)日粮添加色氨酸对肉鸡免疫因子和5-HT合成的影响。应用5-HT的前体物色氨酸(Trp)研究对肉鸡免疫因子和5-HT合成的影响。7 d时,挑选体重相近的肉鸡200只,分别给予添加1%Trp的日粮(处理组)和正常日粮(对照组)饲喂,试验持续3周。结果显示,Trp日粮处理显著降低肉鸡体增重、采食量和腹脂重,上调肝脏、十二指肠、空肠和回肠中5-HT合成限速酶色氨酸羟化酶(TPH1)的基因水平,下调空肠中白介素(IL)-10,回肠中IL-1β和肿瘤坏死因子(TNF)-α的基因水平(p<0.05)。结果表明,日粮添加Trp能够增加体内5-HT的合成,并抑制肠道免疫因子的表达。(3)日粮添加5-羟色氨酸对肉鸡脂肪代谢和免疫因子的影响。试验对7 d的肉鸡给予0.2%的5-HT前体物质5-羟色氨酸(5-HTP)处理,处理3周后分析了对肉鸡脂肪代谢和免疫因子表达的影响。结果显示,5-HTP处理能够显著减少肉鸡腹脂的沉积(p<0.05),对肝脏和腹脂脂肪代谢相关基因分析结果发现仅观测到脂联素(ADP)1R和ADP2R基因水平有差异(p<0.05),其他未见显著变化。与对照组相比,5-HTP处理上调肝脏、十二指肠和回肠的TPH1基因水平,下调十二指肠IL-1β,IL-10和TNF-α,空肠IL-10以及回肠TNF-α的转录水平(p<0.05)。结果表明,肉鸡给予5-HTP处理能够增加体内5-HT的合成,抑制肠道免疫因子的表达,同时改变了机体脂肪代谢。(4)5-HT调控肝细胞内脂肪代谢。挑选18胚龄的SPF鸡胚,用于离体培养肝细胞,并用10μM 5-HT给予处理,观察对脂肪代谢的影响。5-HT处理肝细胞显著减少胞内甘油三酯(TG)的沉积(p<0.05),油红O染色结果与其一致。对AMPK信号通路检测结果发现5-HT处理并未影响单磷酸腺苷激酶(AMPK)/乙酰辅酶A羧化酶(ACC)/肉毒碱棕榈酰转移酶(CPT1)/固醇调节元件结合蛋白(SREBP)-1的蛋白水平。基因水平检测,5-HT处理下调脂肪酸合成酶(FAS),ACC,SREBP-1,CPT1,脂肪酸结合蛋白4(FABP4),脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)和转录因子CCAAT增强子结合蛋白(C/EBP)α的表达,上调脂蛋白酯酶(LPL)和5-HT2A的转录水平(p<0.05)。同时发现,相比于对照组,5-HT处理能够显著减少肝细胞内FAS和苹果酸酶(ME)的活性,增加肝脂酶(HL)活性,抑制了葡萄糖摄取和脂肪酸摄取(p<0.05)。表明5-HT在肝细胞内对TG沉积的抑制是由于脂肪合成减少,分解增加,与氧化利用无关。(5)5-HT调控脂肪细胞内脂肪代谢。与哺乳动物不同的是,家禽体内的脂肪代谢主要发生在肝脏内,脂肪组织是脂肪存储部位,肌肉是脂肪氧化利用的器官。挑选16胚龄的SPF鸡胚,用于离体培养脂肪细胞,并用10μM 5-HT给予处理,观察对脂肪代谢的影响。结果显示,5-HT处理脂肪细胞3 h后,TG含量明显减少(p<0.05),油红O染色结果与其一致。通过蛋白水平检测,发现5-HT刺激细胞激活AMPK/ACC/CPT1和细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路,下调了ATGL基因水平(p<0.05),但对于脂肪合成酶类没有影响。同时,相比于对照组,5-HT处理组减少了葡萄糖摄取和脂肪酸摄取(p<0.05)。给予AMPK抑制剂Compound C后,从TG含量、基因的mRNA表达和蛋白表达方面均表现出抑制5-HT的作用。表明5-HT减少脂肪细胞内TG的沉积主要是通过增加氧化利用,激活AMPK信号通路,与脂肪合成和分解无关。(6)5-HT调控成肌细胞内脂肪代谢。挑选15胚龄的SPF鸡胚,用于离体培养成肌细胞,并用100μM 5-HT给予处理,观察脂肪代谢的影响。结果显示,5-HT(100μM)处理不影响细胞活力。通过检测细胞TG含量和油红O染色发现5-HT处理能够减少脂肪沉积。与对照组相比,100μM 5-HT处理激活AMPK/ACC/CPT1信号通路,上调AMPK、ACC、CPT1、FAS、LPL、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-α、ADP和5-HT2A的转录水平,下调ATGL的表达,减少葡萄糖摄取(p<0.05),对脂肪酸摄取没有影响。之后给予AMPK抑制剂Compound C处理,从基因转录和蛋白水平上均能够缓解5-HT的作用。说明5-HT减少成肌细胞内TG的含量主要是通过氧化利用,激活AMPK信号通路,添加Compound C抑制AMPK信号通路,5-HT作用被抵消。(7)肠道微生物菌群变化对肉鸡5-HT合成及脂肪代谢的影响。试验对3周龄的肉鸡分别给予4%L-阿拉伯糖(L-Ara),10~8 CUF/kg丁酸梭菌(C.butyricum)和联合抗生素(Antibiotics;500 mg/kg盐霉素、500 mg/kg黄霉素、100 mg/k硫酸粘菌素)处理,试验处理5周后,肉鸡肠道菌群变化、体内5-HT合成以及脂肪代谢影响。结果显示,L-Ara,丁酸梭菌和联合抗生素处理能够改变肉鸡肠道菌群,尤其是L-Ara组,减少了菌群丰富度,增加了巨单胞菌属(Megamonas)和普雷沃氏菌(Prevotellaceae UCG-001)的丰度,减少了粪球杆菌(Faecalibacterium)的丰度(p<0.05)。通过对血液5-HT含量的检测,我们发现,肠道菌群改变确实改变了肉鸡体内5-HT的合成(p<0.05),但是血液和肝脏以及腹脂内结果不一,血液是降低了5-HT含量,肝脏和腹脂是增加了5-HT的表达。根据生产性能结果,发现联合抗生素组虽然体重低,但是肝脏发生了明显的脂肪变性,主要是由于增加了肝脏FAS和ME的酶活,上调ACC,ME,LPL和FABP4的基因水平,下调ATGL的转录水平,使得肝脏内脂肪合成增加,TG沉积(p<0.05)。脂肪组织内的基因水平变化与肝脏保持一致。为确定肠嗜铬细胞(EC cell)在肉鸡体内的定位,检测其标志性蛋白TPH1在肠段内的表达,免疫组化和Western Blot结果显示,TPH1主要在十二指肠和盲肠内表达,空肠和回肠内含量较低,且丁酸梭菌处理显著减少TPH1的蛋白表达(p<0.05)。而肝脏作为胆汁酸合成场所,我们发现,L-Ara组和联合抗生素组显著减少肝脏内胆固醇7羟化酶(CYP7A1),胆盐输出泵(BSEP)和Na+/牛磺胆盐共转运体(NTCP)的基因水平,同时降低十二指肠和回肠内顶端钠依赖性胆盐转运体(ASBT)的转录水平(p<0.05)。说明给予肉鸡L-Ara,丁酸梭菌和联合抗生素处理能够改变肉鸡肠道内微生物菌群,从而改变体内5-HT的含量,进一步影响体内的脂肪代谢和胆汁酸代谢。综上所述,5-HT参与肉鸡体内脂肪代谢,在不同组织内调节机制不同,腹脂和肌肉组织主要是通过增加氧化利用途径(AMPK信号通路),而肝脏内主要是通过减少脂肪从头合成(FAS和ME)。肠道微生物的改变能够调节机体内5-HT的合成,这一调控效应可能是通过改变TPH1的表达而实现的。