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本文主要研究了日粮中添加不同剂量的山梨酸对断奶仔猪生产性能的影响,并从细胞与分子水平对山梨酸的作用及其信号转导机制进行了初步研究,旨在为养猪生产中更好地利用山梨酸作为添加剂提高断奶仔猪生产性能提供理论和试验依据。本论文包括3个试验:
试验一山梨酸对断奶仔猪生产性能及免疫功能的影响。240头21d龄三元杂断奶仔猪按照体重接近、公母各半的比例随机分成4组,每组3个重复,每个重复20头。第Ⅰ组为对照组,饲喂基础日粮;第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别在基础日粮中添加0.5g/Kg、2g/Kg、4g/Kg山梨酸。试验期为35天,期间计算采食量、体重、平均日增重和饲料转化率。试验结束时,采集血清和血液样品,半自动生化分析仪测定血清TG、TC、HDL、LDL、TP、ALB、UN等生化指标浓度;放射免疫分析法(RIA)测定IGF-1、T3、T4、胰岛素、皮质醇等激素水平;MTT法检测血液T、B淋巴细胞增殖转化能力。
试验二山梨酸促进肝细胞分泌IGF-1的可能作用机制及其信号转导途径。在试验一中发现,日粮中添加山梨酸能够提高断奶仔猪血液IGF-1的水平。本试验采用改良Seglen“三步”原位灌流法,从5日龄仔猪分离肝细胞,用于以下试验:(1)分别用不同浓度的山梨酸处理肝细胞3h、6h、24h和48h;(2)用不同浓度的Troglitazone(PPARγ激动剂)和GW9622(PPARγ抑制剂)处理肝细胞24h;(3)用100μM山梨酸分别与10nM、100nM、1000nM的Troglitazone和GW9622共处理肝细胞24h;(4)用酪氨酸激酶抑制剂T)Tphostin 23、丝裂原激活蛋白激酶抑制剂PD98059、蛋白激酶C抑制剂GFl0923X分别与Troglitazone、GW9622、和山梨酸共处理肝细胞24h。上述处理结束后分别收集培养上清和肝细胞,RIA法测定上清中IGF-1的浓度;BCA法测定肝细胞总蛋白,用于校正细胞数。
试验三山梨酸对肝细胞相关基因mRNA表达的影响。用100μM的山梨酸处理肝细胞3h、6h、24h和48h,用100nM的Troglitazone和GW9622处理肝细胞24h作参照。用荧光定量PCR检测肝细胞GH/IGFs系统、PPARa和PPARγ等相关基因mRNA表达。
研究结果如下:
(1)日粮添加0.5、2和4g/Kg山梨酸能显著提高断奶仔猪平均日增重(P<0.05)能显著降低耗料增重比(P<0.05);添加2、4g/Kg山梨酸能显著提高血清总蛋白含量(P<0.05)。日粮中添加山梨酸能提高血清IGF-1水平,其中0.5g/Kg剂量组与对照组差异显著(P<0.05)。添加0.5、2g/Kg山梨酸能显著降低皮质醇水平(P<0.05);2g/Kg山梨酸能够显著提高血液中TC、HDL和LDL的浓度(P<0.05);日粮添加2和4g/Kg山梨酸能显著抑制仔猪T、B淋巴细胞的增殖转化(P<0.05)。llxM和10μM山梨酸处理能显著抑制T、B淋巴细胞增殖转化(P<0.05)。
(2)100μM山梨酸在不同处理时间均能显著提高肝细胞IGF-1的分泌水平(P<0.05);不同浓度的Troglitazone能显著提高肝细胞IGF-1的分泌(P<0.05),且显著高于添加同一浓度GW9622的处理组(P<0.05);山梨酸与Troglitazone共处理显著提高IGF-1的分泌水平(P<0.05);提示山梨酸促进IGF-1分泌的作用可能与激活PPARγ的活性有关。Tyrphostin 23、PD98059和GF10923X能显著阻断山梨酸和Troglitazone促进肝细胞IGF-1分泌的作用(P<0.05),提示山梨酸促进IGF-1分泌的作用可能与TK、MAPK、PKC等3条信号转导途径相关。
(3)lOOμM山梨酸处理能显著上调肝细胞IGF-1、IGF-1R以及IGF-2基因mRNA的表达(P<0.05);100μM山梨酸能显著上调PPARa基因mRNA的表达:100μM山梨酸对PPARγ mRNA的表达无显著影响。