论文部分内容阅读
单纯疱疹病毒Ⅱ型(herpes simplex virus type 2,HSV-2)主要引起生殖器疱疹。HSV-2感染机体后,可潜伏于骶神经节中,免疫系统和药物均无法有效清除病根。由于其易复发和潜伏感染的特性,相关疫苗的研制成为了预防感染的重点。DNA疫苗特异性强,能在体内持续表达从而激发持久的细胞免疫和体液免疫,从而成为疱疹病毒疫苗研究的热点。然而DNA疫苗的免疫原性较弱,需要合适的疫苗佐剂才能发挥有效作用。板蓝根多糖(IRPS,Isatis root polysaccharide)有可能是一种良好的免疫佐剂,这与诸多因素有关。近年来研究发现,IRPS能促进DC细胞成熟、激活巨噬细胞和释放相关细胞因子(如TNF-α)、调节T细胞免疫类型、促进免疫球蛋白生成等。IRPS的提取方法主要有水煎醇沉法、超声波法、微波法等。与传统的水煎醇沉法相比,超声波法和微波法辅助提取多糖具有降低浸提温度,缩短浸提时间,提高产率,保证产品结构和理化性质稳定性等优点,但是微波法和超声波法是否会对IRPS结构或活性有影响还未见报道,需要进一步探讨。综上,本研究使用水煎醇沉法、超声波法、微波法提取IRPS,探究不同提取方法对IRPS含量和产率的影响,探讨不同提取方法提取的IRPS对小鼠脾脏T细胞增殖的影响以及脾细胞分泌的细胞因子的影响,最后为探讨IRPS作为疫苗佐剂对HSV-2 DNA疫苗免疫效果的影响,本研究将多糖与本实验室已有的含HSV-2糖蛋白D全基因序列的HSV-2 DNA疫苗pgD共同免疫BALB/c小鼠,观察其作为佐剂的免疫增强效果,研究内容包括:1)按IRPS的不同提取方法分成Water组(水煎醇沉法)、US-1组(超声波75W,0℃冰浴,30min)、US-2 组(超声波 100W,0℃冰浴,30min)、US-3 组(超声波 125W,0℃冰浴,30min)、MW-1 组(微波 350W,6min)、MW-2 组(微波 450W,6min)、MW-3组(微波600W,6min),苯酚-硫酸法测定多糖含量,比较产率,之后在体外研究不同提取方法的多糖对小鼠脾脏T细胞增殖的影响以及脾细胞分泌IFN-γ和IL-10水平的影响,观察不同提取方法的免疫刺激活性。2)将 40 只 BALB/c 小鼠分成 PBS 组、pgD 组、pgD+IRPS 组、pKan+IRPS 组、IRPS组,于小鼠后腿肌肉注射,经初次免疫后经过2周再免疫1次。末次免疫2周后,对小鼠进行眼球采血,分离血清,ELISA法检测血清IgG水平和IgG1、IgG2a亚型抗体滴度;制备小鼠的脾细胞,MTS法检测小鼠脾脏T细胞增殖能力;ELISA法检测脾细胞内分泌IFN-γ和IL-10的水平。体外结果表明,US组和MW组得到的多糖产率高于Water组,所有US组诱导的脾脏T细胞增殖能力高于Water组(P<0.05),US-2组IFN-γ水平高于Water组(P<0.05),US-2 和 US-3 组的 IL-10 水平高于 Water 组(P<0.05)。体内实验结果表明,小鼠血清中pgD+IRPS组的IgG水平显著高于其他4组(P<0.01),IgG1和IgG2a的滴度均显著高于pgD组(P<0.01),而且IgG2a/IgG1的比值也高于pgD组(P<0.05);pgD+IRPS组的小鼠脾脏T细胞增殖能力强于pgD组(P<0.05);经 ELISA 检测,pgD+IRPS 组的 IFN-γ水平显著高于 pgD 组(P<0.01),IL-10的水平也显著高于pgD组(P<0.01)综上所述,超声波法和微波法能提高IRPS的产率,而且超声波提取法在一定条件下能提高多糖的免疫活性。IRPS作为疫苗佐剂能显著增强HSV-2 DNA疫苗pgD的IgG水平,提高脾脏T细胞增殖能力,能够显著提高HSV-2 DNA疫苗pgD诱导的体液免疫与细胞免疫,介导以细胞免疫为主的Th1/Th2混合型免疫反应。以上结果说明IRPS具有良好的疫苗佐剂效应,能显著增强DNA疫苗的免疫原性,具有广阔的应用前景。