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第一部分:ZD55-TRAIL对多发性骨髓瘤(MM)细胞株的生长抑制及诱导凋亡作用目的:研究ZD55-TRAIL对MM细胞株的生长抑制及诱导凋亡情况,从而为进一步研究ZD55-TRAIL的抗骨髓瘤凋亡机制打下基础。方法:MTT法检测ZD55-TRAIL对骨髓瘤细胞株的生长抑制作用,流式细胞术分析ZD55-TRAIL对骨髓瘤细胞株的感染率,Hoechst染色法观察ZD55-TRAIL诱导MM细胞凋亡的形态学改变,Western-blot法检测ZD55-TRAIL作用后Caspase-3. Caspase-8、Caspase-9和PARP蛋白的表达变化,Western-blot法检测IGF-1R及其下游NF-KB靶蛋白表达变化。结果:(1)0~40MOI的ZD55-TRAIL分别作用于RPMI8226、MM1S、MM1R细胞株24小时之后,IC50约3-78MOI,0-20MOI的ZD55-TRAIL分别作用于RPMI8226、MM1.S、MM1.R细胞株48小时之后,IC50约2~6.4MOI。表明骨髓瘤细胞株包括DXM-敏感和DXM-耐药的细胞株对ZD55-TRAIL均敏感。(2)0~50MOI的ZD55-TRAIL分别作用于RPMI8226细胞株24h和48h后,在荧光显微镜下观察GFP表达呈时间和剂量依赖性增加,流式细胞术检测5MOI、25MOI、50MOI时的GFP表达率分别为16.8%、52.8%和62.9%。(3)分别以0~10MOI的ZD55和ZD55-TRAIL作用于RPMI8226细胞株48小时后,MTT检测细胞活性,发现ZD55-TRAIL具有更强的细胞毒性,而ZD55细胞毒力较小。(4)外源性IL-6(10ng/ml)不能逆转ZD55-TRAIL诱导的RPMI8226凋亡,提示ZD55-TRAIL可以抑制细胞因子诱导的细胞生长。(5)以16MOI的ZD55-TRAIL作用于RPMI8226细胞株24h后,与对照组相比细胞核内可见明显的凋亡小体,从形态学上证明ZD55-TRAIL可以诱导MM细胞发生凋亡。(6) ZD55-TRAIL诱导RPMI8226细胞株凋亡时,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和PARP激活,Bcl-xl下调。TRAIL蛋白表达呈剂量依赖性增加,其死亡受体DR4、DR5无明显变化。(7)ZD55-TRAIL能够下调IGF-1R(mRNA和蛋白水平)及其下游NF-KB靶蛋白,但对P110a、P110δ影响不大。(8)外源性IGF-1不能够逆转ZD55-TRAIL对MM细胞的杀伤作用和蛋白抑制作用。第二部分:溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL协同PI3K抑制剂LY294002或蛋白酶体抑制剂MG132诱导MM细胞株死亡及机制研究目的:研究溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL协同LY294002或MG132促进MM细胞的凋亡作用,并探讨协同促凋亡的机制。方法:通过MTT法检测ZD55-TRAIL联合PI3K抑制剂或蛋白酶体抑制剂对MM细胞株和正常肝脏细胞株LO2的生长抑制作用,Western-blot法检测Caspase-3、PARP, PI3K/Akt/mTOR通路的相关蛋白表达情况,集落形成实验观察细胞克隆情况,结晶紫染色观察对正常肝脏细胞株LO2的的杀伤作用,Hoechst染色法观察联合处理对RPMI8226细胞株诱导凋亡后的形态学变化。结果:(1)MTT结果显示溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL与PI3K抑制剂LY294002具有协同抑制MM的作用。(2) Western-blot结果显示单独溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL处理RPMI8226细胞株后,出现Akt/mTOR通路蛋白的激活。但PI3K抑制剂LY294002联合后能够增强ZD55-TRAIL诱导细胞凋亡,caspase-3、PARP蛋白激活明显,且对Akt/mTOR通路相关蛋白的靶向抑制作用更明显。(3)蛋白酶体抑制剂MG132与溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL, MTT结果显示有较好的协同作用,CI<1。并对正常肝脏细胞株L02无抑制。(4) Western-blot显示较低剂量的MG132和ZD55-TRAIL联合即可引起凋亡明显增强,Caspase3、Caspase8、Caspase9和PARP激活,TRAIL的死亡受体DR5增强明显,而DR4激活不明显。单独浓度梯度的MG132也可引起DR5上调而DR4表达不变。(5)集落培养进一步证实ZD55-TRAIL与MG132具有协同抗MM作用。(6)结晶紫染色证实MG132和ZD55-TRAIL的联合处理对L02细胞株无杀伤作用。结论:骨髓瘤细胞株包括DXM-敏感和DXM-耐药的细胞株对溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL敏感,可诱导凋亡,并抑制IGF-1R和下游的NF-κB靶蛋白。ZD55-TRAIL与LY294002联合可克服病毒本身引起的Akt/mTOR的激活,促进细胞凋亡。另外,死亡受体DR5的上调可能是ZD55-TRAIL与MG132协同诱导凋亡的机制之一。这些发现为以后以TRAIL为基础的腺病毒治疗与PI3K抑制剂或蛋白酶体抑制剂的临床联合使用提供依据。