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miRNAs是一种长度约为22-25nt的小非编码RNA分子,在转录后水平调控基因的表达。miR-26b是目前研究较多的一个miRNA,广泛参与细胞增殖、凋亡、分化、迁移和自噬等多种细胞过程的调控。在猪卵巢组织中,实验室前期研究发现miR-26b在卵泡闭锁过程中表达上调,促进卵泡颗粒细胞凋亡。目前猪miR-26b前体特征尚不清楚,其调控猪卵泡颗粒细胞凋亡的机制研究也较少。本文通过克隆获得了猪miR-26b前体序列,利用生物信息学方法分析了其序列与结构特征;利用生物信息学方法预测和试验验证miR-26b在猪卵泡颗粒细胞凋亡中的作用;利用生物信息学方法和多种试验技术鉴定miR-26b的靶基因,并分析了 miR-26b调控猪卵泡颗粒细胞凋亡的信号通路,为解析miR-26b调控猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡机制提供依据。本文研究结果主要包括以下几个方面:1、猪miR-26b前体的克隆和序列分析以猪基因组DNA为模板,通过扩增测序获得85bp猪miR-26b前体序列,同源性比对发现猪miR-26b前体序列与哺乳动物其它物种高度保守。哺乳动物miR-26b成熟序列高度一致,与斑马鱼和海七鳃鳗相比,也仅在11位核苷酸处出现U-C突变。脊椎动物miR-26b种子序列均为UCAAGUA。RNAfold软件预测发现猪miR-26b的二级结构为典型的发夹结构,另外还含有四个不对称的突起,这可能与其转录活性的调节有关。研究结果表明哺乳动物miR-26b高度保守,推测miR-26b的功能在哺乳动物中具有相似性。miRNA主要通过靶基因发挥作用,KEGG pathway分析发现miR-26b的靶基因主要富集在凋亡、PI3K-Akt、FoxO和TGF-p等信号通路中,其中凋亡相关通路富集的靶基因最多,提示miR-26b可能是一个凋亡相关的miRNA。体外试验发现在猪卵泡颗粒细胞中过表达miR-26b后,颗粒细胞凋亡率显著增加,且可显著抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达,表明miR-26b可促进猪卵泡颗粒细胞凋亡,是猪卵泡颗粒细胞中的促凋亡因子。2、miR-26b通过靶向USP9X调控猪卵泡颗粒细胞凋亡生物信息学分析发现USP9X是miR-26b的一个候选靶基因。荧光素酶活性分析发现miR-26b显著抑制USP9X-3’UTR荧光素酶载体活性,但对突变型USP9X-3’UTR荧光素酶载体活性无影响,表明miR-26b可与USP9X基因3’UTR直接结合并抑制USP9X的表达。在体外培养的猪卵泡颗粒细胞中过表达mi-26b可极显著降低USP9X基因mRNA和蛋白水平,说明mi-26b可靶向抑制猪卵泡颗粒细胞中USP9X的表达。敲减USP9X可极显著增加猪卵泡颗粒细胞凋亡率,显著增加促凋亡基因Bax和降低抗凋亡基因Bcl-2表达水平,说明USP9X可以抑制猪卵泡颗粒细胞凋亡。另外,将miR-26b inhibitor和USP9X-siRNA共转体外培养的猪卵泡颗粒细胞,发现猪卵泡颗粒细胞凋亡率显著增加,说明miR-26b可通过靶向抑制USP9X调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。前人研究发现Samd4是USP9X的下游基因,USP9X可通过去泛素化减少SMAD4蛋白的降解来增强其生物学功能。本文进一步分析了 USP9X调控猪卵泡颗粒细胞凋亡的机制。敲减USP9X后猪卵泡颗粒细胞中SMAD4基因mRNA表达水平无显著变化,而SMAD4蛋白水平显著降低,表明USP9X可促进猪卵泡颗粒细胞中SMAD4蛋白表达。过表达SMAD4可促进猪卵泡颗粒细增殖,敲减SMAD4则可促进颗粒细胞凋亡。而过表达或者抑制miR-26b,可分别显著抑制或者促进猪卵泡颗粒细胞中SMAD4的表达,表明miR-26b可通过USP9X-SMAD4轴调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。同时,TGF-β/SMAD信号通路中的配体TGF-β1也参与了猪卵泡颗粒细胞中miR-26b-USP9X-SMAD4信号通路的调控。另外,我们发现在猪CYP19A1基因启动子区存在SBE(SMAD结合位点),荧光素酶活性分析发现,过表达或者敲减SMAD4后可促进或者抑制CYP19A1基因启动子活性。过表达SMAD4可促进猪卵泡颗粒细胞中CYP19A1表达和雌激素合成。综上所述,miR-26可通过靶向抑制USP9X-SMAD4-CYP19A1通路中USP9X调控猪卵泡颗粒细胞凋亡的通路。3、miR-26b通过靶向HAS 2调控猪卵泡颗粒细胞凋亡实验室前期研究发现miR-26b可通过靶向HAS2调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。本文首先利用生物信息学方法、点突变和荧光素酶报告系统,进一步证实miR-26b可与HAS2基因3’UTR直接结合抑制HAS2的表达。qRT-PCR和Western blot发现HAS2基因mRNA和蛋白在猪健康卵泡中的表达水平分别显著或极显著高于闭锁卵泡,表明HAS2可能参与了猪卵泡闭锁的调控。敲减HAS2可显著增加猪卵泡颗粒细胞凋亡,而过表达HAS2则显著降低猪卵泡颗粒细胞凋亡,表明HAS2可抑制猪卵泡颗粒细胞凋亡。另外,将miR-26b inhibitor和HAS2-siRNA共转体外培养的猪卵泡颗粒细胞,发现猪卵泡颗粒细胞凋亡显著增加,说明miR-26b可通过靶向抑制HAS2调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。HAS2是HA合成的关键酶,而HA是通过激活CD44和抑制Caspase-3的表达来抑制卵泡颗粒细胞凋亡的。本文进一步分析了 miR-26b通过HAS2调控猪卵泡颗粒细胞凋亡的通路。敲减HAS2可极显著降低猪卵泡颗粒细胞培养液中HA的浓度和CD44基因表达,激活Caspase-3基因表达,与抑制miR-26b对HA- CD44-Caspase-3通路的影响相反;敲减HAS2可抑制miR-26b inhibitor对HA- CD44-Caspase-3通路的调控,表明miR-26b可通过HAS2调控下游通路HA-CD44-Caspase-3。外源添加HA可显著影响猪卵泡颗粒细胞中CD44和Caspase-3基因表达,显著降低颗粒细胞凋亡率,并可挽救HAS2-siRNA和miR-26b引起的颗粒细胞凋亡,说明miR-26b可通过HAS2-HA-CD44-Caspase-3通路来调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。综上所述,本文获得了猪miR-26b前体基因序列,进一步证实其是猪卵泡颗粒细胞中的促凋亡因子。USP9X和HAS2是猪卵泡颗粒细胞中miR-26b的直接靶基因,miR-26b 可通过 USP9X-SMAD4-CYP19A1 信号通路和 HAS2-HA-CD44-Caspase-3 信号通路调控猪卵泡颗粒细凋亡。因此,本文发现了两个新的调控猪卵泡闭锁和卵泡颗粒细胞凋亡的信号通路:miR-26b-USP9X-SMAD4-CYP19A1通路和miR-26b-HAS2-CD44-Caspase-3 通路。