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鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis, DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus, DHV)所引起的一种急性、致死性传染病。本病主要感染1月龄以内的雏鸭,尤其以2周龄以内的雏鸭最易感染,给养鸭业造成巨大经济损失。种鸭免疫接种鸭肝炎疫苗是预防下一代雏鸭鸭肝炎的最佳方法,本试验围绕鸭肝炎弱毒活疫苗免疫产蛋种鸭、雏鸭后的免疫效果展开系列研究：①建立和应用间接酶联免疫吸附实验(ELISA)和鸡胚中和法检测体液免疫；②用淋巴细胞转化实验(MTT法)检测细胞免疫；③用强毒攻击雏鸭检测疫苗的保护效果；④建立间接免疫过氧化物酶染色法(ⅡS)检测接种疫苗后DHV-Ⅰ弱毒在不同时间的分布状况,为阐明弱毒活疫苗的免疫机理提供实验数据。获得了如下试验结果：1.检测鸭肝炎抗体的间接ELISA方法建立以氯仿去脂、超速离心结合蔗糖密度梯度离心法纯化的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)作为包被抗原,建立了检测鸭肝炎病毒抗体的间接ELISA,该方法具备较高的特异性、敏感性。抗原纯化后的蛋白含量为1.9242 mg/ml, HRP-羊抗鸭IgG最佳稀释度为1：2000,包被抗原和血清最佳稀释度分别为1：200(病毒含量为9.621μg/ml)、1:100,临界值为0.2439。利用该方法检测鸭瘟、大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、禽霍乱等阳性血清,结果均为阴性,表明该方法与其它血清无交叉反应,特异性好。敏感性试验结果表明,间接ELISA方法的敏感性明显高于中和试验,两者呈平行关系。特异性、敏感性试验结果表明建立的ELISA法可以用于检测鸭肝炎抗体。2.种鸭免疫试验产蛋种鸭免疫1羽份鸭肝炎弱毒活疫苗,在免疫后的第3、5、7、14、21、28、35、42、49、56d采血做MTT试验及分离血清,收集种蛋分别用于孵化雏鸭及提取卵黄抗体。用ELISA与鸡胚中和法测定血清及卵黄抗体的抗体滴度,用强毒攻击孵出的后代雏鸭。免疫后的第3d就可用ELISA检测到血清和卵黄中的ELISA抗体,血清和卵黄中的抗体滴度分别在21d和28d达到最高峰,随后缓慢下降,到第56d时两者仍然都呈阳性。免疫后的第5d就可用中和试验检测到血清和卵黄中的中和抗体,血清和卵黄中的中和抗体滴度分别在21d和28d达到最高峰,随后有所下降,到第56d时两者仍然较高。这表明用ELISA检出的血清和卵黄抗体消长情况与用中和试验检出的消长情况基本一致。未免疫组种鸭的血清和卵黄经两种方法检测均为阴性。MTT法检测免疫鸭的外周血的淋巴细胞的转化结果显示从3d起,试验组与阴性对照组存在显著差异(P<0.05),到21d时达到最大差异。免疫种鸭的后代雏鸭用10000 LD50强毒攻击,5d时的后代雏鸭就能产生保护力,保护率为10%,5-21d的保护率逐渐上升,到21d时达到最大保护率100%,28-56d都保持100%的保护率,而阴性对照组种鸭的后代雏鸭的保护率为O。第三组产蛋种鸭间隔2周共免疫2次,每次免疫1羽份鸭肝炎疫苗,在首次免疫后的30、60、90、120、150、180d采血分离血清,用ELISA与中和法检测抗体,抗体滴度比只免疫一次的明显要高,且在6个月内都保持较高的滴度。3.雏鸭免疫试验无鸭肝炎母源抗体的雏鸭在1日龄免疫1羽份鸭肝炎弱毒疫苗,在免疫后第3、5、7、10、15、30d采血做MTT试验及分离血清,用ELISA与中和法检测血清效价。在3d时就可检测到血清中的ELISA抗体与中和抗体,10d时达到最高效价,随后下降,但到30d时仍为阳性。MTT法检测免疫雏鸭的外周血的淋巴细胞的转化结果显示从3d起,试验组与对照组就存在极显著差异(P<0.01),到10d时达到最大差异。采血后的雏鸭用10000 LDso强毒攻击,在3d时产生保护力,保护率为40%,3-10d逐渐上升,10d时达到最大保护率90%,而未免疫组雏鸭保护率为0。4.免疫组化法检测DHV-Ⅰ疫苗弱毒在雏鸭体内的分布规律以蔗糖密度梯度离心法纯化的DHV-Ⅰ免疫兔制得兔抗DHV-Ⅰ抗体,建立了免疫组化检测石蜡组织切片中的DHV-Ⅰ抗原的方法。试验结果表明建立的免疫组化与感染DHV-Ⅰ强毒死亡鸭的肝脏呈阳性反应,而与大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、鸭瘟感染发病和死亡鸭的肝脏组织进行免疫组化检测均显阴性。雏鸭免疫鸭肝炎弱毒苗后,在一系列设定的时间点扑杀并采集各个组织器官,并用建立的免疫组化法检测弱毒在各组织中的分布情况,结果表明：雏鸭免疫12h后的不同时间,在肝脏、肾脏、脾脏、法氏囊、胸腺、肌肉、肠道均可检测到鸭肝炎疫苗抗原,抗原位于细胞质中。经免疫组化检出的弱毒的时间顺序为(“>”意为“早于”)：肝脏、脾脏、肾脏>胸腺、法氏囊、哈氏腺、盲肠、十二指肠、胰腺、肌肉>直肠、心脏、肺>脑。7d时弱毒主要分布在肝、脾、肾脏、胸腺、法氏囊、哈氏腺、各段肠道中,呈中等阳性,14d时弱毒几乎在所有组织都呈强阳性分布,随后有所下降。