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禽大肠杆菌病(Avian Colibacillosis)是养禽业最严重的传染病之一,给养禽业造成了巨大经济损失,至今尚无有效的防治措施。禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic E.coli,APEC)分离株众多,其详细致病机理还有待深入研究,但是已经证实众多的毒力基因是其主要致病因子。Ⅵ型分泌系统(typeⅥ secretion system,T6SS)是一种新型分泌系统,Hcp管道是其主要结构,在细菌致病过程中扮演重要角色。本研究以Hcp主要亚单位hcp1和hcp2基因为切入点,探讨其在APEC CE129菌株感染宿主过程中的病原性。 试验通过比对NCBI上hcp1、hcp2基因的已知序列,利用λ噬菌体Red同源重组系统对禽致病性大肠杆菌(APEC)野生株CE129的Ⅵ型分泌系统(T6SS) hcp1和hcp2基因进行敲除。首先各设计一对引物用于检测实验菌株APEC CE129是否含有hcp1和hcp2基因,引物分别与GeneBank中已知的hcp1和hcp2基因序列5端同源。然后根据试验菌株的hcp1和hcp2基因再各设计一对引物,其5端分别与hcp1和hcp2基因序列两侧同源,而3端则与质粒pKD3的氯霉素抗性基因Cat同源,用于获得带氯霉素抗性基因的PCR产物,纯化后导入含有质粒pKD46的APEC CE129菌株中,在Red重组酶Beta、Exo、Gam作用下,氯霉素抗性基因片段依靠两侧同源序列与细菌染色体的靶基因发生重组,将hcp1和hcp2基因置换下来,通过氯霉素抗性平板筛选获得阳性克隆,即完成一次重组。再电转化导入编码Flp重组酶的质粒pCP20,通过对Cat两侧Flp位点的识别,消除抗性基因,即完成二次重组。最后通过PCR特异性检测和测序结果,验证缺失株CE129△hcp1、CE129△hcp2和CE129△hcp1△hcp2的成功构建。体外竞争试验结果表明,△hcp1缺失株在与野生株的竞争中处于微弱劣势,其毒力被轻度弱化。血清杀菌试验结果显示,相比野生株CE129,缺失株CE129△hcp1、CE129△hcp2、 CE129△hcp1△hcp2抵抗血清补体杀菌的能力分别下降32.7%、35.1%和50.6%(p<0.01)。生物膜定性定量试验结果表明,△hcp2缺失株形成生物膜能力下降40%(p<0.01),回补株上升至87%。DF1细胞黏附试验结果表明,△hcp2缺失株的黏附能力下降46%(p<0.01),回补株上升至96%。鸡胚体内感染试验结果显示,△hcp1和△hcp2单缺失株在鸡胚体内的增殖水平约为野生株的1/3,△hcp1△hcp2双缺失株约为野生株的1/2。Real Time PCR定量试验结果显示,hcp1和hcp2基因具有协同表达关系;相比野生株CE129,缺失株CE129△hcp1对群体感应luxS、lsrR、pfs基因表达量分别下降29%、41%、33%(p<0.05),hcp1回补株分别上升至85%、98%、96%,对抗血清存活因子ompA和iss基因表达量分别下调29%和24%(p<0.05),回补株分别上升至109%和105%;缺失株CE129△hcp2对菌毛fimA基因表达量下调47%(p<0.01),hcp2回补株上升至88%,对黏附相关基因fimC和papC基因表达量分别下降60%和37%(p<0.01),回补株分别上升至84%和96%,对抗血清存活因子ompA和iss基因表达量分别下调31%和41%(p<0.05),回补株分别上升至109%和88%。综上所述,CE129的hcp2基因在细菌黏附,生物膜形成和血清杀菌过程中扮演重要角色,而hcp1基因在细菌体外竞争,群体感应和抗补体存活方面发挥作用,证明了Hcp直接与间接的介导了APEC CE129对宿主的致病过程。