研究目的1.探索麻疹减毒活疫苗Hu191株(MV-Hu191病毒株)对胰腺癌的体外溶瘤作用,比较MV-Hu191病毒株对胰腺癌细胞与胰腺正常上皮细胞生长的影响。2.探索MV-Hu191病毒株对人胰腺癌细胞株BxPC-3、Panc-1自噬活性的影响,阐释其杀伤胰腺癌细胞的潜在分子机制。3.探索MV-Hu191病毒株对人胰腺癌细胞株BxPC-3、Panc-1凋亡过程的影响,阐释其杀伤胰腺癌细胞的潜在分子机制。4.探索MV-Hu191病毒株感染后,人胰腺癌细胞株BxPC-3、Panc-1培养上清中TGF-β1、TNF-α表达水平的变化,阐释其对胰腺癌微环境的影响。研究方法在工具细胞Vero上扩增MV-Hu191病毒株,采用反复冻融、低温高速离心的方法收集MV-Hu191病毒液,应用空斑形成单位法滴定病毒滴度、检测病毒增殖动力。在MV-Hu191病毒株感染人胰腺癌细胞BxPC-3、Panc-1与人胰腺正常导管上皮细胞HPDE6-C7后的24h-96h,通过倒置显微镜观察BxPC-3、Panc-1细胞的病变效应与合胞体的形成,以及HPDE6-C7细胞的形态学变化。在MV-Hu191病毒株以不同MOI感染BxPC-3、Panc-1与HPDE6-C7细胞后的24h-96h,应用CCK-8法检测细胞增殖活力。比较MV-Hu191病毒株对胰腺癌细胞与胰腺正常上皮细胞生长的影响。2.选取在自噬调控中发挥关键作用的LC3、P62、Beclin1蛋白,引入自噬抑制剂氯喹(CQ)与自噬诱导剂雷帕霉素(RAPA)作为阴性与阳性对照。在感染MV-Hu191病毒株后的24h-96h,应用SYBRGreen法进行qPCR扩增,检测BxPC-3、Panc-1细胞内LC3、P62基因的表达变化。将BxPC-3、Panc-1细胞按MV组、MV+CQ组、MV+RAPA组、CQ组、RAPA组、control组分组加药,在病毒感染后的24h-96h,应用CCK-8法检测细胞的增殖活力,比较干预后各组存活率的差异;在病毒感染后的8h-96h,提取蛋白进行WesternBlot实验,观察药物干预后各组细胞内P62、LC3B、Beclin1蛋白表达水平的变化。在感染MV-Hu191病毒株后进行间接免疫荧光检测,观察P62蛋白荧光强度的变化。3.选取在凋亡调控中发挥关键作用的Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白,引入凋亡抑制剂Z-VAD-FMK与凋亡诱导剂星形孢菌素(STS)作为阴性与阳性对照。将BxPC-3、Panc-1 细胞按 MV 组、MV+STS 组、MV+Z-VAD-FMK 组、STS 组、Z-VAD-FMK组、control组分组加药,在MV-Hu191病毒株感染后的24h-96h,应用CCK-8法检测细胞的增殖活力,比较干预后各组存活率的差异;提取蛋白进行Western Blot实验,观察药物作用后细胞内Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达水平的变化。收集此前MV组、MV+CQ组、MV+RAPA组、CQ组、RAPA组、control组的蛋白进行Western Blot实验,观察自噬药物作用后细胞内Caspase-3蛋白表达水平的变化。感染MV-Hu191病毒株后进行间接免疫荧光检测,观察Bax蛋白荧光强度的变化。在细胞感染病毒后的48h-96h,应用流式AnnexinV-FITC/PI双染法检测BxPC-3、Panc-1细胞的凋亡率,比较MV组与control组间的差异。4.选取胰腺癌微环境中的重要介质转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)与TNF-α,探索MV-Hu191病毒株对胰腺癌细胞微环境的影响。在BxPC-3、Panc-1细胞感染MV-Hu191病毒株后的72h-96h,收集细胞上清液,应用Elisa法检测TGF-β1、TNF-α的浓度水平,比较MV组与control组间的差异。研究结果1.MV-Hu191病毒株感染BxPC-3、Panc-1细胞后呈现典型的病变效应,有合胞体形成;而HPDE6-C7细胞形态则未发生明显变化。MV-Hu191以MOI=0.5感染 BxPC-3 细胞后的 24h-96h,细胞存活率分别为 61.92%、56.92%、53.75%、45.76%;以 MOI=0.5 感染 Panc-1 细胞后的 24h-96h,存活率分别为 68.58%、64.01%、50.99%、46.31%;以MOI=0.5感染HPDE6-C7细胞后的24h-96h,存活率分别为93.44%、85.62%、85.68%、83.49%;MV-Hu191 对 BxPC-3、Panc-1 细胞的抑制作用明显强于HPDE6-C7细胞。2.CCK-8结果显示,MV-Hu191病毒株感染BxPC-3、Panc-1细胞后的24h-96h,MV组与CQ组对两株细胞的生长有抑制作用,而RAPA组对两株细胞的生长有促进作用;MV+CQ组的存活率在24h-96h时低于MV组与CQ组,而MV+RAPA组的存活率在48h-96h时高于MV组。qPCR结果显示,MV-Hu191感染BxPC-3、Panc-1细胞后的24h-96h,自噬相关基因LC3与P62的表达逐渐增加,且P62增加更为显著。WesternBlot结果显示,MV-Hu191感染BxPC-3、Panc-1细胞后的最初8h-24h,两株细胞的MV组均出现了 Ⅱ型LC3B表达增加,且Panc-1细胞MV组的P62表达减少,Beclin1表达增加,说明此时癌细胞内的自噬活动仍较活跃。在MV-Hu191感染后的48h-96h,两株细胞的MV组均出现了 P62表达增加、Ⅱ型LC3B表达增加,LC3BⅡ/Ⅰ比值增加,Beclin1表达减少,说明MV阻断了自噬体与溶酶体的融合,遏制了自噬产物在溶酶体中的降解,癌细胞内的自噬过程受到抑制。MV+CQ组的P62、Ⅱ型LC3B较MV组表达进一步增加,Beclin1较MV组表达进一步减少,MV与CQ产生了协同作用。免疫荧光结果显示,MV组P62蛋白的荧光强度显著强于control组。3.CCK-8结果显示,MV-Hu191病毒株感染BxPC-3、Panc-1细胞后的24h-96h,MV组与STS组对两株细胞的生长有抑制作用,而Z-VAD-FMK组对Panc-1细胞的生长有促进作用;MV+STS组的存活率显著低于MV组与STS组,而MV+Z-VAD-FMK组的存活率高于MV组。Western Blot结果显示,MV-Hu 191感染后的最初24h,两株细胞的Bax、Bcl-2、Caspase-3表达变化不显著。在MV-Hu191作用后的48h-96h,相较于control组,MV组的Bax表达增加、Bax的相对表达量与病毒MOI呈线性相关,Bcl-2表达减少,Bax/Bcl-2比值不断升高,MV组出现活化的Caspase-3片段;而MV+STS组的Bax较MV组表达进一步增加,Bcl-2表达进一步减少,活化型Caspase-3较MV组、STS组表达进一步增加,说明MV促进了内源途径介导的癌细胞凋亡,MV与STS产生了协同作用。此外,MV+CQ组的活化型Caspase-3表达高于MV组与CQ组,提示MV与CQ在抑制癌细胞自噬的同时,也诱导了凋亡。免疫荧光结果显示,MV组Bax蛋白的荧光强度显著强于control组。流式Annexin V-FITC/PI双染结果显示,MV-Hu191作用于BxPC-3后的96h,MV组、control组的AnnexinV染色阳性率分别为(15.10±2.12)%、(4.25±0.78)%;作用于 Panc-1 后的 96h,MV 组、control 组的 AnnexinV 染色阳性率分别为(15.20±2.26)%、(5.15±0.07)%;MV组凋亡率显著高于control组。4.Elisa结果显示,MV-Hu191病毒株作用于BxPC-3、Panc-1细胞后的72h-96h,细胞上清中的TGF-β1浓度低于control组,而TNF-α浓度高于control组,说明MV能抑制胰腺癌细胞分泌TGF-β1,促进其分泌TNF-α。结论MV-Hu191病毒株对人胰腺癌细胞株BxPC-3、Panc-1具有良好的溶瘤效果,而对胰腺正常导管上皮细胞HPDE6-C7的抑制作用弱。MV-Hu191病毒株感染胰腺癌细胞BxPC-3、Panc-1后,通过抑制胞内自噬过程杀伤胰腺癌细胞。MV-Hu191病毒株感染胰腺癌细胞BxPC-3、Panc-1后,通过诱导细胞凋亡杀伤胰腺癌细胞。MV-Hu191病毒株感染胰腺癌细胞BxPC-3、Panc-1后,通过抑制TGF-β1的分泌、促进TNF-α的分泌改变胰腺癌的微环境。