禽流感(Avian Influenza)是由A型流感病毒引起的一种禽类的感染和/或疾病综合征。其中高致病性禽流感(HPAI)是近几年来在许多国家流行、给养殖业带来巨大经济损失、并且威胁到人类健康的一种烈性传染病。AIV的快速检测技术是有效控制AI流行的检测手段和重要前提,因此我们进行了本研究。M1蛋白是流感病毒的型特异性蛋白,是流感病毒分型的主要依据,并且在A型流感病毒的进化过程中具有变异缓慢、高度保守性的特点,因此可以作为检测抗原来诊断各亚型AIV。NS1蛋白是流感病毒的非结构蛋白,具有高度的保守性,在病毒复制的早期就大量表达,仅出现于被病毒感染的细胞内,并且能诱导机体产生NS1抗体。因此NS1蛋白可作为一种检测抗原,通过检测NS1抗体来区分野毒感染和疫苗免疫的禽群。本研究利用重组AIV M1蛋白和NS1蛋白作为检测抗原,相应蛋白免疫家兔获得的阳性血清作为阻断抗体,分别建立了M1间接阻断ELISA和NS1间接阻断ELISA。M1间接阻断ELISA的工作条件为:M1最佳包被浓度为0.78μg/mL,阻断抗体最佳稀释度为1:15 000,待检血清最佳稀释度为1:10,羊抗兔酶标二抗工作浓度为1:15 000;NS1间接阻断ELISA的工作条件为:NS1最佳包被浓度为0.6μg/mL,阻断抗体最佳稀释度为1:10000,待检血清最佳稀释度为1:10,羊抗兔酶标二抗工作浓度为1:15 000。(1)M1阻断ELISA:对38份禽类阳性和26份禽类阴性样本的检测结果表明,本方法的敏感性为97.37%,特异性为96.16%。交叉反应试验证明本方法与NDV等8种其它禽病阳性血清不发生交叉反应。对268份临床样品进行检测,结果表明M1阻断ELISA与HI试验的符合率可达92%以上。(2)NS1阻断ELISA:对42份禽类感染血清和50份灭活疫苗免疫禽血清的检测结果表明,本方法的敏感性为95.2%,特异性为90.0%。交叉反应试验证明本方法与NDV等8种其它禽病阳性血清不发生交叉反应。临床检测结果表明,对186份灭活疫苗免疫禽血清、20份基因工程疫苗免疫血清和42份健康非免疫禽血清样本的阴性率为89.2%、95%和100%。(3)M1间接阻断ELISA和NS1间接阻断ELISA的比较:检测感染血清时,M1间接阻断ELISA敏感性更高,在检测健康非免疫禽时,NS1间接阻断ELISA特异性更高。研究表明:这两种方法均可不受动物种属和禽流感血清亚型约束,一次性检测多种属动物不同血清亚型抗体水平。其中M1间接阻断ELISA可以为免疫家禽血清中生成抗体水平的检测提供有效的定量依据,更可以为判断非免疫养殖禽类、野生禽类是否感染禽流感病毒提供了快速可靠的实验室检测方法。而NS1间接阻断ELISA则可以根据NS1抗体水平来区分自然感染禽群和疫苗免疫禽群,以此作为早期感染的依据。临床应用中,两种方法配合使用可以进一步区分禽流感自然感染、灭活苗免疫和健康非免疫禽群,为净化禽群提供了一种切实可行的血清学诊断方法。