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足细胞(podocyte)是一种高度分化的细胞,是肾小球滤过屏障的重要结构组成部分。当肾脏遭到外界刺激时,会导致足细胞功能损伤,进而产生大量蛋白尿。因此,大量研究认为糖尿病肾病(DN)的发生、发展可能与肾足细胞损伤有关。前期研究发现环境污染物镉暴露会加速DN的发生,但具体发病机制尚未完全阐明。DN在中医领域归为水肿、消渴等范畴,而中药黄芪具有利水消肿,补气升阳,活血化瘀,滋阴补肾等功效,自古以来被用于糖尿病肾病的治疗,黄芪甲苷是黄芪药效的主要物质基础,已有研究提出黄芪甲苷能够延缓DN的进展,但其作用机制尚未明确。本课题拟通过构建镉诱导足细胞损伤模型,探讨黄芪甲苷对足细胞的保护作用及可能的作用机制。通过构建镉致小鼠肾足细胞(MPC5)损伤模型,同时给予黄芪甲苷保护,探讨镉毒性对细胞数量、形态、亚细胞器线粒体状态、蛋白及基因水平的影响以及黄芪甲苷的保护作用,旨在阐明镉诱导MPC5细胞损伤的作用方式及黄芪甲苷的保护机制。具体研究内容如下:(1)MPC5细胞培养及镉诱导MPC5细胞损伤模型的建立:采用不同温度、有无γ-干扰素诱导MPC5细胞,使其高度分化,筛选分化成熟的细胞;MTT法筛选CdCl2作用于MPC5细胞的浓度和时间;Annexin V-FITC/PI结合流式细胞术对镉暴露MPC5细胞晚期凋亡及坏死情况分析;(2)镉暴露诱导MPC5细胞损伤机制的研究:检测镉暴露组细胞氧化、抗氧化指标;利用流式细胞术检测镉暴露组细胞内总ROS含量;JC-1标记结合流式细胞术比较各组细胞线粒体膜电位变化;利用荧光倒置显微镜观察JC-1标记的线粒体膜电位荧光强度变化;采用Western blot和RT-PCR技术分析镉暴露组足细胞结构、功能蛋白、线粒体自噬通路PINK1/Parkin蛋白及mRNA的表达情况;利用荧光倒置显微镜对线粒体自噬通路蛋白进行免疫学检测;(3)基于足细胞结构、功能变化和PINK1/Parkin通路研究黄芪甲苷对镉诱导MPC5细胞的保护作用:MTT法筛选黄芪甲苷作用于镉损伤细胞模型的浓度;采用流式细胞术检测不同浓度黄芪甲苷作用于镉损伤细胞的死亡率;检测黄芪甲苷组细胞氧化、抗氧化水平;检测黄芪甲苷组细胞内总ROS含量;线粒体膜电位变化;分析黄芪甲苷组足细胞结构、功能蛋白、线粒体自噬通路PINK1/Parkin蛋白及mRNA的表达情况;线粒体自噬通路蛋白免疫学检测。结果表明,将MPC5细胞暴露于含6.25 μM浓度的CdCl2培养液中,于0h、12h、24h、48h分别取样检测,6.25μM CdCl2作用的细胞死亡率较低,但随着镉暴露时间的延长,MPC5细胞死亡率增加。镉暴露诱导MPC5细胞损伤机制的研究:镉暴露各组氧化产物MDA含量显著上升(P<0.01),抗氧化产物SOD活力明显降低(P<0.001);镉暴露组细胞ROS峰值有所偏移,上升水平不明显;镉暴露各组线粒体膜电位都呈现不同程度的降低;且线粒体膜电位荧光染色表明镉暴露引起线粒体凋亡;与N组相比,镉暴露组Nephrin蛋白表达显著下降(P<0.05),Desmin蛋白表达显著升高(P<0.05),细胞自噬蛋白LC3-Ⅱ,镉暴露12h组表达极显著升高(P<0.001);与N组相比,镉暴露12h、24h组线粒体自噬通路蛋白PINK1显著升高(P<0.05),48h组升高较显著(P<0.01),Parkin蛋白都有一定程度的下降,但下降程度无显著性差异;对线粒体自噬通路mRNA水平的检测,与N组相比,镉暴露48h组PINK1的mRNA含量显著升高(P<0.01);Parkin的mRNA水平有所降低;线粒体自噬通路蛋白的免疫学检测,结果进一步表明镉诱导MPC5细胞损伤可能与线粒体自噬失调相关。基于足细胞结构、功能变化和PINK1/Parkin通路研究黄芪甲苷对镉诱导MPC5细胞的保护作用:12.5μM、25μM、50μM浓度黄芪甲苷分别作用于镉损伤细胞24h;与镉暴露组相比,黄芪甲苷组MDA含量明显下降;SOD活力降低;黄芪甲苷组ROS强度图比较接近空白组;黄芪甲苷组线粒体膜电位极显著升高(P<0.001);与镉暴露组相比,黄芪甲苷组足细胞结构、功能蛋白及线粒体自噬通路蛋白的表达,有较明显的改善。通过本研究揭示了镉致MPC5细胞的损伤可能与线粒体自噬紊乱、氧化应激失调有关,进而诱导了 MPC5细胞死亡;而黄芪甲苷通过调节线粒体自噬水平,清除自由基,维持机体氧化-抗氧化的动态平衡来实现其保护作用。