由于生活水平日益提高,饮食结构的变化和预防保健措施的相对滞后,肝纤维化已经成为一种全球性病症,尤其我国,其发病率有明显增高的趋势。肝纤维化研究的重要性在于：(1)肝纤维化是各种肝病发展成肝硬化的必经病理过程；(2)肝纤维化是阻止发展肝硬化过程中唯一可靠的治疗时机；(3)世界范围内对慢性肝病治疗的两大策略即抗病毒治疗和阻止肝纤维化的发生。目前,尚无特效抗病毒疗法治疗慢性病毒性肝炎。因此,肝病的治疗重点转移到如何防止肝纤维化以致肝硬化的发生、发展方面,随之而来的是对肝纤维化发生机制的研究。肝纤维化是由各种致病因子如酒精、乙肝病毒等所致肝内损伤组织修复过程中的代偿性反应,表现为肝脏内纤维结缔组织的细胞外基质(Extra cellular matrix, ECM)过度沉淀。肝星状细胞(Hepatic stellate cells, HSC)的活化和增殖是肝纤维化形成的中心环节。肝细胞损伤的其中一个重要机制是由于细胞受到外源或内源性刺激产生的氧化应激(oxidative stress, OS),导致细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)过度产生,与膜磷脂的多不饱和脂肪酸发生氧化反应形成脂质过氧化物(lipoperoxides, LPO)。LPO可直接损害细胞膜并导致细胞死亡,并且可抑制抗氧化系统,削弱细胞防御机制。最重要的是其可激活HSC细胞,诱导HSC产生大量胶原蛋白,促进肝纤维化的发生。几乎所有临床和实验性肝纤维化都被证实与氧化应激有关,而抗氧化剂可以减慢或阻止肝纤维化的发展。细胞珠蛋白(Cytoglobin, Cygb)作为一种细胞内抗氧化蛋白,是最初由日本Tawada等在2001年在大鼠纤维化肝脏的星状细胞内发现了此种蛋白。其基因定位于染色体17q25,含有4个外显子和3个内含子,编码190个氨基酸残基,分子量20.9KDa,拥有经典的螺旋三明治折叠结构。由于其紧凑的螺旋形结构和结合血红素的能力,Cygb可可逆的结合各类气体分子,如氧气、一氧化氮等。Cygb在缺氧时表达上调且特定地表达在毛细血管周围,提示其可能具有氧感受器的作用。Cygb可作为清道夫,清除组织缺血后再灌注时产生的ROS和N0分子。此外,Cygb具有过氧化氢酶活性,在肝星状细胞中起过氧化物清除剂的作用。最近有研究显示,Cygb对肝纤维化的逆转有着非常显著的作用。由本实验室构建的肝纤维化大鼠模型中,注射了Cygb的治疗组与未注射Cygb的对照组相比,前者纤维化肝脏组织有了明显的逆转。研究证明Cygb作为一种源于人体大部分内脏器官的正常蛋白,其毒副作用小,在抗肝纤维化的临床治疗中将占有重要地位。因此,本研究着重于研究Cygb在肝纤维化中抗氧化作用的分子机制从而找到其治疗肝纤维化的具体信号通路。有研究显示Cygb广泛分布各脏器中,主要表达于结缔组织成纤维细胞中,如肝星状细胞、成软骨细胞等。由于国际上对Cygb在细胞内的确切亚定位仍存在争议,其常用的定位方式是利用绿色荧光蛋白标签(Green Fluorescent Portein, GFP)。因此,本实验利用FLAG标签(8个氨基酸残基)结合细胞免疫荧光实验,对照GFP标签的定位方式来验证Cygb在肝星状细胞中的确切定位。目前国际上对Cygb能有效抗纤维化的具体机制和通路不甚明了,因此本研究建立优化的免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)结合双向电泳-质谱的方法来寻找与Cygb相互作用的蛋白,分析这些相互作用蛋白已知的功能和分子通路,间接预测出珠蛋白在治疗肝纤维化过程中的具体作用机制。由于文献报道,Cygb可能通过抑制氧化应激反应等方式抵御和逆转肝纤维化进程。因此用一定浓度的H202刺激肝星状细胞系(LX-2),构建细胞氧化应激模型。通过在不同时间点检测氧化应激相关指标,观察LX-2细胞氧化应激的发生、抵御和清除的大致时间分布。为了更清楚的研究LX-2细胞在氧化应激过程中Cygb与相关基因转录水平的变化,利用荧光定量PCR(Quantitative polymerase chain reaction, QPCR)的方法分别检测在H202刺激下,不同时间点Cygb与其相互作用蛋白mRNA的表达情况,从而分析氧化应激对这些基因的影响以及基因间的相互关系。根据以上目的,本研究细分三部分,第一部分是Cygb真核表达载体的构建、表达及在LX-2细胞中的定位,第二部分是免疫沉淀-双向电泳-质谱联合方法的建立与筛选与Cygb相互作用的蛋白,第三部分是Cygb与其相互作用蛋白AKR7A2在H202诱导LX-2细胞氧化应激下的mRNA表达量变化。第一部分通过提取人肝星状细胞系(LX-2)总RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得Cygb的cDNA,以cDNA为模板使用PCR法扩增得到Cygb编码序列。将其酶切后分别连接至带有GFP标签和带有FLAG标签的真核表达载体上,酶切与测序鉴定其阳性克隆。随后将重组质粒pEGFP-N1-Cygb和pcDNA3.0-Cygb-FLAG分别瞬时转染LX-2细胞,经Western-blot鉴定两组表达情况。转染GFP标签载体48h后直接在倒置荧光显微镜下观察；转染FLAG标签载体48h后进行细胞免疫荧光实验,在倒置荧光显微镜下观察荧光情况。通过两组对照,分析Cygb在LX-2细胞中的确切定位。结果显示,将Cygb基因克隆到真核表达载体,经PCR、双酶切和测序等鉴定,成功构建了pEGFP-N1-Cygb和pcDNA3.0-Cygb-FLAG重组真核表达载体。分别用抗GFP抗体和抗FLAG抗体对表达产物进行Western-blot鉴定,发现特异性条分别带出现在48KDa和21KDa处,成功在LX-2细胞中表达出特异性重组蛋白Cygb。采用脂质体法瞬时转染LX-2细胞48h,经DAPI细胞核染色,在倒置荧光显微镜下检测结果显示：转染了pEGFP-N1-Cygb的细胞中,表达的融合蛋白Cygb-GFP绿色荧光均匀分布在细胞质和细胞核中,而转染pcDNA3.0-Cygb-FLAG的细胞显示Cygb-FLAG融合蛋白红色荧光主要分布于除细胞核以外的细胞质中。第二部分通过传统免疫沉淀方法与优化的免疫沉淀结合双向电泳的方法进行对比实验,研究后者的方法能否成功筛选出相互作用蛋白。优化中,为了减少了非特异性蛋白的干扰、达到双向电泳前的低盐状态以及减少蛋白的损失,在传统免疫沉淀的洗涤和洗脱步骤中,把普通离心管换成特殊离心柱子,在洗涤步骤的最后一步用20mmM的Tris溶液洗涤2次达到除盐效果,并换成双向电泳兼容的新洗脱液洗脱复合物。经免疫沉淀-双向电泳方法得到一个特异性蛋白点,经(?)ALDI-TOF质谱分析,再根据该蛋白的已知功能推断Cygb的分子通路。结果显示,优化的免疫沉淀结合双向电泳的方法比传统免疫沉淀更能减少杂蛋白对结果的影响。该方法成功找到与Cygb相互作用蛋白。经质谱鉴定,与Cygb相互作用的蛋白为黄曲霉素醛还原酶(Aflatoxin B1aldehyde reductase member2, AKR7A2).其属于AKR7家族,定位于高尔基体,参与过氧化氢、醛和酮的解毒,具有超强的抗氧化应激能力,能有效减少脂质过氧化反应产生的醛,甚至能缓解细胞中DNA损伤。其涉及的2个通路为Nrf2/ARE通路与PPARY通路。第三部分建立H202诱导的细胞氧化应激模型,先用不同浓度的H202刺激LX-2细胞使其发生氧化应激,用CCK-8检测细胞存活率情况,从而确定最优H202的刺激浓度。然后用最优H202浓度刺激LX-2细胞,在不同时间点检测氧化应激相关指标ROS、NO、超氧化物阴离子,来确定LX-2细胞氧化应激的发生、抵御和清除的大致时间分布。同时,以该时间分布为依据选用Oh、2h、8h、24h、36h、48h时间点收集H202刺激后的LX-2细胞提RNA、逆转录后,通过QPCR的方法分别检测的Cygb与AKR7A2基因的mRNA表达变化,分析氧化应激对这些基因的影响以及基因间的相互关系。结果显示：CCK-8实验得到H202最优刺激浓度为80μM。用该浓度刺激LX-2细胞,在倒置荧光显微镜下观察ROS.NO和超氧化物阴离子的荧光强度：在5min内,细胞快速产生ROS、NO以及超氧化物阴离子,在30min-lh内达到顶峰。ROS在2h后被细胞清除完全,而而NO、超氧化物阴离子则在12h后还能检测得到。超氧化物阴离子在24h后被完全清除,NO则仍有微量残留。QPCR结果显示：在刺激2h后,AKR7A2迅速上调2.6倍,而Cygb在8h内反而下调。12h后,Cygb上调到1.9倍并最终在48h上调到4.8倍。而AKR7A2在12h上调5.7倍,在24h下降到3.2倍,而在36h又升高到5倍。综合以上结果得出结论：1.成功地构建了pEGFP-N1-Cygb和pcDNA3.0-Cygb-FLAG重组真核表达载体,并在LX-2细胞中表达出特异性重组蛋白Cygb。2.可能由于GFP分子量大等多种原因,导致带GFP标签的融合蛋白定位与带FLAG标签的定位差异。结合文献资料,带FLAG标签的融合蛋白定位结果更加可信,因此Cygb主要分布于细胞质中,在细胞质发挥主要功能。3.成功建立免疫沉淀-双向电泳-质谱联合方法,筛选出的黄曲霉素醛还原酶与Cygb相互作用。Cygb可能共同参与黄曲霉素醛还原酶涉及的Nrf2/ARE通路与PPAR γ通路,具有类似的抗氧化功能。甚至可能通过PPARγ信号通路及NF-κB通路等抑制HSC的增殖从而抑制肝纤维化的发生。4.H2O2诱导LX-2细胞氧化应激模型,在几分钟后快速产生大量ROS,NO等,在24h后基本被清除完全。是由于在应激过程中,ROS主要通过细胞内超氧化物歧化酶等抗氧化酶被迅速清除干净。但Cygb由于NO等的抑制作用下在8h内表现为下调,在12h后开始上调,Cygb的延后性很可能是因为在氧化应激的前期,并不是主要发挥抗氧化的功能,而是作为脂质过氧化信号激活抗氧化系统,如醛还原酶(AKRs)。因此可以推测Cygb作为信号分子与AKR7A2相互作用,促进了AKR7A2的抗氧化作用。而AKR7A2通过Nrf2/ARE信号通路,在氧化应激前期快速上调,并一直处在一个较高的表达水平,快速清除脂质过氧化反应产生的毒性醛、酮和过氧化物。由于AKR7A2的表达存在波动性,提示AKR7A2具有负反馈作用,使得其表达量维持在一定范围内。而Cygb具有NO双加氧酶(nitric oxide dioxygenase, NOD)活性,能有效清除NO,因此在12h后与AKR7A2一同发挥抗氧化应激作用,修复氧化应激造成的细胞损伤,从而有效抑制肝纤维化甚至是转归。综上所述,本研究通过细胞内定位,相互蛋白的筛选与氧化应激下Cygb与其相互作用蛋白mRNA的表达变化来初步探索细胞珠蛋白在肝纤维化中氧化应激的具体分子机制,为研究Cygb在细胞内相关生物学功能和肝纤维化治疗上提供新的理论基础,也为探寻Cygb新靶点和寻找治疗肝纤维化的药物提供新思路。