第一部分:神经生长因子参与肠易激综合征动物模型结肠高敏感发生的机制研究研究背景和目的:肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是消化系统最普遍的一种功能紊乱性肠病,其不仅给患者的生活质量造成巨大的影响,同时带来了较高的医疗费用。近些年随着IBS相关研究不断深入和发展,其发病原因可能与肠道屏障受损,菌群失调,免疫异常,内脏感觉过敏,脑肠轴互动异常等因素有关。其中,内脏敏感性增高作为IBS重要的病理生理学特征被广泛认可,然而我们对其诱发原因知之甚少。通常认为,IBS患者肠神经系统(enteric nervous system,ENS)存在显微结构的改变和功能异常。ENS由大量位于胃肠道壁内的多种类型的神经元以及肠胶质细胞(enteric glia cells,EGCs)共同组成。有研究报道,EGCs表面存在多种受体,可以感知肠道环境中的各种刺激并且随之发生一系列反应,可表现为细胞增生,形态改变及功能异常等。我们前期研究中发现,在IBS患者和内脏高敏感动物模型中,EGCs数目和超微结构均存在改变,提示EGC功能异常可能参与IBS发病。神经生长因子(nerve growth factor,NGF)是神经营养素家族的重要成员,其主要作用为促进神经元分化,发育以及神经轴突的生长。大量研究表明NGF是炎性痛的重要调节介质,在维持外周伤害性刺激诱发的疼痛中起重要作用。早期研究发现腹泻型IBS患者结肠粘膜NGF表达增加,并参与肠道神经元的分化以及神经元可塑性的调控,提示NGF在IBS患者腹痛的发生过程中发挥重要作用。然而,NGF升高的起始因素及相关的分子机制仍不清楚。丁酸是由肠道厌氧菌发酵食物中难消化的碳水化合物所产生的一类短链脂肪酸,有报道称腹泻型IBS患者粪便中丁酸含量增加,并且动物模型已证实丁酸钠连续灌肠3天可以造成结肠高敏感,可见丁酸与内脏高敏感的发生密切相关。有研究表明,丁酸钠可改变组蛋白乙酰化状态从而增加星型胶质细胞神经营养素的表达。鉴于EGCs与星型胶质细胞在形态与功能上的相似性,我们推测丁酸可能作用于肠道中的EGC,引起NGF表达及分泌增加,促进IBS内脏高敏感的发生。研究方法:1.使用5 mmol/L 丁酸钠处理体外培养的EGC 6小时后,转录组测序分析差异基因表达及重要信号通路的改变;2.使用丁酸钠灌肠建立IBS动物模型,实验组给予2 ml 1 mol/L 丁酸钠溶液灌肠,对照组予以等体积的生理盐水溶液灌肠,每天1次,连续3天。于第3天灌肠后24小时行结直肠扩张(colorectal distention,CRD)实验,球囊中快速注入不同体积(0.2 ml,0.4 ml,0.6 ml,0.8 ml,1.0 ml)的生理盐水,观察腹壁撤退反射(abdominal withdrawal reflex,AWR),记录评分,以此反映大鼠内脏感觉的变化。评分结束后处死大鼠,取末段结肠组织,通过qPCR,western blots方法测定结肠NGF表达水平,并分析NGF表达量与AWR评分之间的关联性;3.免疫荧光检测大鼠结肠粘膜EGC与NGF共表达情况,并检测新生神经纤维密度,探讨丁酸钠是否能促进肠胶质细胞分泌NGF,导致神经纤维密度增加进而引起内脏高敏感;4.体外培养大鼠肠胶质细胞系CRL-2690,以不同浓度(1mmol/L,5mmol/L,10 mmol/L)的丁酸钠和去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素 A(trichostatin A,TSA,100 nmol/L,500 nmol/L)刺激 EGC 6小时和24小时后,通过qPCR,western blots,ELISA等方法检测NGF表达水平。研究结果:1.与对照组相比,5 mmol/L丁酸钠处理组共筛选出8375个差异基因,其中,4346个基因表达上调,4029个基因表达下调。从差异基因KEGG富集散点图来看,丁酸钠显著影响neurotrophin signaling pathway通路,其中在此通路上的124个基因中,59个基因表达上调,33个基因表达下调。4种神经营养素家族重要成员上调显著,包括NGF,BDNF,NT3,NT4。在丁酸钠处理组,NGF基因表达上调3.2倍。2.AWR评分显示,丁酸钠灌肠后大鼠结肠敏感性明显增加。在球囊注入0.6 ml和0.8 ml体积生理盐水的扩张压力下,丁酸钠组比对照组的内脏感觉评分分别为2.96 ±0.68分vs.1.92 ±0.63分(P<0.05)和3.58 ±0.46分vs.2.46±0.73分(P<0.01)。在丁酸钠灌肠组,大鼠结肠组织NGFmRNA水平上调5.7倍,蛋白水平上调3.1倍。同时我们对qPCR和western blots测得的NGF表达量与AWR评分进行了相关性分析。结果显示,在不同的球囊扩张压力下,大鼠结肠NGF mRNA表达水平与AWR评分之间呈显著相关,不同的球囊扩张体积下,各相关系数分别为 0.6 ml(r = 0.6194,P=0.0105),0.8 ml(r = 0.8840,P<0.001)和1.0 ml(r = 0.7466,P<0.001)。同时结肠NGF蛋白表达水平与AWR评分之间也存在显著相关性,不同的球囊扩张体积下,各相关系数分别为0.6 ml(r=0.5739,P = 0.0201),0.8 ml(r = 0.8170,P<0.001)和 1.0 ml(r = 0.6565,P =0.0057)。3.免疫荧光双标结果表明GFAP和NGF存在共位表达,提示EGC分泌NGF。荧光双标统计结果显示EGC的标记物GFAP表达与对照组相比无显著差异,而NGF的表达量高于正常对照组,EGC特异性表达的NGF含量也高于对照组。结肠粘膜新生神经纤维标记物生长相关蛋白-43(growth associated protein-43,GAP43)在两组之间表达无显著差异。4.体外培养的CRL-2690细胞中,不同浓度的丁酸钠处理均可以引起NGF mRNA及蛋白水平显著升高,TSA与丁酸钠的作用效果近似,也可促进细胞NGF表达增加,表明丁酸钠引起NGF分泌增多可能由其改变组蛋白乙酰化状态发挥作用。研究结论:1.丁酸钠灌肠可导致大鼠内脏敏感性升高,大鼠结肠组织NGF表达上调并且与内脏感觉评分呈显著相关。2.丁酸钠灌肠后大鼠结肠组织分泌增多的NGF主要来源于粘膜固有层内的EGC。体外培养的EGC证实丁酸钠促进NGF合成和释放增多可能由其作为去乙酰化酶抑制剂而发挥作用。第二部分:miR-204-5p在腹泻型肠易激综合征患者结肠粘膜中的表达和腹痛的相关性分析及机制研究研究背景和目的:肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是以肠道运动或内脏感觉异常为主要特征的肠道功能紊乱性疾病。因此,探索降低IBS患者结肠高敏感状态的方法,对临床上IBS患者的症状缓解具有重要意义。MicroRNAs(miRNAs)是由内源基因组编码的单链小分子RNA。miRNAs主要通过与mRNA3’-UTR端互补配对结合来实现对靶基因的调控,最终导致靶基因mRNA降解或蛋白翻译受到抑制,发挥生物学功能。多项研究表明miRNAs异常表达参与了多种疾病的发生,包括胃肠道疾病。有报道称腹泻型IBS患者结肠粘膜组织中miR-29a通过调控紧密连接蛋白Claudinl的表达改变肠道通透性。另一项研究显示IBS患者结肠miR-199显著降低,导致其靶基因辣椒素受体(transient receptor potential vanilloid type 1,TRPV1)表达上调,且与患者腹痛症状呈显著相关。我们的前期研究中IBS-D患者血清样本small RNA测序结果显示miR-204-5p显著下调。通过targetscan等miRNA靶基因预测软件以及查阅文献报道过的已经验证的miR-204-5p靶基因,我们发现EphB2受体可直接受miR-204-5p调控,该受体可通过改变神经元活性以及突触可塑性参与多种疼痛的发生。有研究已证实EphB2受体活化后可诱导N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体的募集和活化,引起cAMP.反应序列结合蛋白(cAMP response element-binding protein,CREB)磷酸化水平增加,从而使神经元活化标记物c-fos表达增加,促进突触形成和伤害性信息的传入。因此本研究旨在于探讨IBS患者异常表达的miR-204-5p是否能通过调控其靶基因EphB2的表达参与内脏高敏感的发生。研究方法:1.依据功能性胃肠病罗马Ⅲ标准纳入腹泻型IBS(diarrhea-predominant IBS,IBS-D)患者,对照组纳入因肠道息肉或肿瘤筛查而接受结肠镜检查者,所有纳入者内镜下表现均无明显异常。所有研究对象留取全血样本及直乙状交界处结肠粘膜标本,分别选用5例年龄及性别匹配的IBS-D患者和健康对照组的血清标本进行small RNA测序分析,我们初步筛选出在IBS-D患者中显著下调的miR-204-5p作为研究对象,在结肠粘膜标本中使用qPCR技术对其表达进行进一步验证,同时行EphB2免疫组化染色,并分析其表达量与腹部症状之间的相关性;2.应用FISH技术观察人结肠粘膜组织中miR-204-5p的分布情况;3.构建含有EphB2 3’-UTR部分序列(含有miR-204-5p结合部位)的野生型以及突变型荧光素酶报告质粒,分别与miR-204-5p mimic或miR-204-5p inhibitor共转染HEK293T细胞,转染24小时后检测细胞的荧光素酶活性;4.培养SH-SY5Y细胞,分别转染 miR-204-5p mimic 和 miR-204-5p inhibitor,western blots 检测 EphB2,NR1,CREB,p-CREB,c-fos的表达;5.使用TNBS灌肠建立内脏高敏感小鼠模型,记录AWR评分,qPCR方法检测结肠组织miR-204-5p表达,免疫组化染色及western blots检测EphB2及c-fos蛋白表达;6.TNBS小鼠模型成功建立后随机分为2组,实验组每只小鼠每次接受腹腔注射5nM miR-204-5p agomar治疗,每隔2天给药一次,对照组给予相同剂量的无意义片段链,治疗1周后评估小鼠内脏敏感性的变化,后处死小鼠取末段结肠组织,检测EphB2和c-fos蛋白表达。研究结果:1.IBS-D患者血清small RNA测序结果显示129个microRNA表达显著异常,其中71个表达上调,58个表达下调。通过初步筛选,我们挑选出具有显著差异的miR-204-5p,利用qPCR技术验证IBS-D患者结肠粘膜miR-204-5p表达情况。结果显示miR-204-5p在IBS-D患者中表达显著下调。同时我们使用免疫组化染色方法测定IBS-D患者结肠粘膜EphB2表达,定量分析结果表明,与对照组相比,IBS-D患者结肠粘膜EphB2表达上调1.87倍(P<0.01)。相关性分析结果显示,所有纳入者结肠EphB2表达量与腹部症状的严重程度之间呈显著相关性(r=0.5765,P<0.001),EphB2表达量与腹部症状的发作频率之间同样存在显著相关性(r=0.6177,P<0.001)。2.FISH结果显示miR-204-5p主要分布于结肠粘膜固有层内,与肠胶质细胞共定位结果显示miR-204-5p可由肠胶质细胞表达。3.在体外培养的HEK293T细胞系中,EphB2野生型质粒与miR-204-5p mimic共转染细胞时,相对荧光值显著低于EphB2突变型质粒与miR-204-5p mimic共转染细胞时的荧光值(P<0.05)。相反的,当EphB2野生型质粒与miR-204-5p inhibitor共转染细胞时,相对荧光值高于EphB2突变型质粒与miR-204-5p inhibitor共转染细胞时的荧光值(P<0.05)。4.在体外培养的SH-SY5Y细胞系中,当细胞转染 miR-204-5p mimic 时,western blots 结果显示 EphlB2,NR1,CREB,p-CREB,c-fos蛋白表达均减少,下调倍数分别为1.95倍,2.67倍,1.97倍,1..89倍和 4.08 倍(P<0.05)。而当细胞转染 miR-204-5p inhibitor 时,EphB2,NR1,CREB,p-CREB,c-fos蛋白表达均增加,分别上调2.07倍,2.99倍,1.87倍,1.86倍和4.32倍(P<0.05)。5.TNBS灌肠4周后,小鼠结肠组织miR-204-5p显著下调,且EphB2,c-fos蛋白表达分别增加4.27倍和1.50倍(P<0.05)。6.TNBS诱导的内脏高敏感小鼠接受miR-204-5p agomir治疗1周后结肠敏感性降低,对照组比治疗组小鼠引起疼痛反应的球囊扩张体积为3.13 ± 0.10 ml vs.3.62 ± 0.06 ml(P<0.001)。同时miR-204-5p agomir治疗组小鼠结肠组织EphB2下调1.96倍(P<0.001),c-fos 表达下调 4.28 倍(P<0.001)。研究结论:1.IBS-D患者结肠粘膜miR-204-5p显著下调,可由肠胶质细胞表达,miR-204-5p可靶向结合EphB2基因,同时IBS-D患者结肠粘膜EphB2蛋白表达增多,且与患者腹痛及腹部不适症状呈显著相关。2.在体外培养的神经元细胞系中,miR-204-5p可负性调控EphB2及下游通路蛋白,影响神经元活化。3.TNBS诱导的内脏高敏感小鼠结肠组织miR-204-5p显著下调,并且结肠组织EphB2及c-fos蛋白表达增多,miR-204-5p agomir治疗后能显著减少EphB2及c-fos蛋白表达,从而降低小鼠结肠高敏感。