目的:恶性胸腔积液的发病率在全球范围内不断增加,但目前用于鉴别良恶性胸腔积液的特异性生物标记物仍未确定。本研究旨在通过前瞻性地分析一组新的肿瘤特异性基因在胸腔积液中的甲基化状态,探讨甲基化组合（SHOX2、RASSF1A和HOXA9）在良恶性胸腔积液鉴别诊断中的临床应用价值。方法:留取2019年10月-2020年7月就诊于中国医科大学附属第一医院和沈阳市胸科医院的患者的胸腔积液标本200例,4℃离心后留取胸水沉渣进行基于RT-PCR的体外诊断试验,并对3个基因（SHOX2、RASSF1A和HOXA9）在胸腔积液中的甲基化状态进行了定性分析。最终从152名通过细胞学和/或组织学检查和临床演变确诊的患者中收集到152个连续的胸腔积液样本。结果:152个胸腔积液样本中,恶性101（66.5%）例,男46（45.5%）例,女55（54.5%）例,年龄25-79（60.6±13.3）岁;良性51（33.5%）例,男37（72.5%）例,女14（27.5%）例,年龄24-80（58.1±13.0）岁。101例引起恶性胸腔积液的原发病中,其中68例为肺癌（54例肺腺癌,6例肺鳞癌,4例小细胞肺癌和4例未分类肺癌）,另外33例为肺外转移癌（5例胸膜间皮瘤、14例乳腺癌,6例妇科肿瘤,4例消化道肿瘤,2例血液病和2例其他类型的肿瘤）;在51例引起良性胸腔积液的疾病中,22例为结核性胸膜炎,19例为肺炎旁胸腔积液,10例为其他疾病引起。3个基因在恶性胸腔积液中的阳性检出率分别为43.6%（RASSF1A）、56.4%（SHOX2）和63.4%（HOXA9）,特异性分别为100%（RASSF1A）、96.1%（SHOX2）和98.0%（HOXA9）。SHOX2和RASSF1A组合检测取得双基因组合里的最佳诊断效能,敏感性74.3%,特异性为96.1%,阳性预测值为97.4%,阴性预测值为65.3%。3个基因联合检测（任一基因甲基化阳性）的敏感性为80.2%（81/101）,特异性为94.1%（3/51）,阳性预测值和阴性预测值分别为96.4%和70.6%。结论:对SHOX2、RASSF1A和HOXA9在胸腔积液中的DNA甲基化状态定性分析可作为快速无创鉴别良恶性胸腔积液的诊断方法。SHOX2和RASSF1A基因甲基化的联合检测被认为是筛选和监测恶性胸腔积液的优良方法,具有较高的敏感性和特异性,而HOXA9则是一个很好的补充。三项联合检测可显著提高诊断的敏感性和特异性。