论文部分内容阅读
研究背景宫颈癌(Cervical cancer,CC)是妇科常见的恶性肿瘤,多数为鳞癌,其次为腺癌,导致该病的最主要危险因素是高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)的反复持续感染。HPV是一种球形DNA病毒,能够引起人类表皮和黏膜鳞状上皮的增殖。高危型HPV编码三种早期蛋白,其中E5转化作用较弱,E6、E7为病毒癌基因,靶向降解抑癌基因P53和Rb,使细胞无限增殖。HPV主要通过性传播,患者早期症状不明显,晚期出现阴道不规则流血等症状。近几年宫颈癌疫苗的上市和接种使发病率有效降低,但该疫苗不能预防所有类型HPV感染,不能完全防止宫颈癌的发生,对于宫颈癌患者的治疗仍存在很大挑战。宫颈癌转移方式主要为向邻近组织直接蔓延和淋巴转移,晚期宫颈癌侵犯并压迫周围盆腔组织和器官,并通过淋巴液转移至各级淋巴结,预后较差。Rab蛋白是GTP结合蛋白家族成员,在胞内主要定位于反式高尔基体网络和内体,负责调控细胞内膜通路,调节囊泡和物质运输。有大量研究表明,Rab31在癌症的发生发展中起作用,并与多种癌症的预后相关。Rab31在乳腺癌组织中高表达,并促进癌细胞增殖,是乳腺癌的独立预后因素;Rab31在多形性胶质母细胞瘤中表达上调,并促进其发展;Rab31在胰腺癌中高表达,是胰腺癌低生存率的预后标志物;Rab31在骨肉瘤组织中高表达,促进癌细胞的增殖、侵袭和转移;在胃癌组织中,Rab31高表达,促进癌细胞的增殖,并抑制其凋亡。然而,Rab31在宫颈癌侵袭转移中的作用及机制还缺乏具体的研究,我们的前期质谱结果表明,HPV E6,E7癌基因上调Rab31的表达,因此本实验研究Rab31对宫颈癌侵袭转移的影响和机制。研究目的探究Rab31在宫颈癌侵袭转移中发挥的作用及机制实验方法与结果1.Rab31在宫颈癌细胞和组织中高表达利用qRT-PCR和Western Blot技术,在正常细胞HaCaT和宫颈癌细胞系HeLa、SiHa、CaSki、C33a中检测Rab31的mRNA和蛋白表达水平,结果表明,Rab31在宫颈癌细胞中高表达,且在HPV阳性的癌细胞中表达量更高。通过qRT-PCR技术,检测患者非癌宫颈组织和宫颈癌组织中Rab31的表达量。结果显示,Rab31在宫颈癌组织中的表达量高于非癌宫颈组织。由此可见,Rab31在宫颈癌中呈现高表达水平。2.降低Rab31的表达能够抑制宫颈癌细胞的侵袭和转移能力,过表达Rab31促进宫颈癌细胞的侵袭和转移以Rab31表达量高的HPV18型HeLa细胞和HPV16型SiHa细胞为研究对象,利用慢病毒感染技术,在两种细胞中敲低Rab31的表达。通过细胞划痕试验和Transwell试验,探究Rab31低表达后对宫颈癌细胞侵袭和转移的影响。结果表明,敲低Rab31的表达后,侵袭和转移的细胞数目减少,抑制了癌细胞的侵袭和转移能力。在Rab31表达相对较低的C33a细胞中,利用外源性质粒过表达Rab31,划痕试验和Transwell试验表现与上述相反的结果,癌细胞侵袭和转移的数目增多,过表达Rab31促进了宫颈癌细胞的侵袭和转移能力。3.降低Rab31的表达,能够抑制癌细胞EMT途径并减少F-actin的聚合来抑制宫颈癌细胞的侵袭和转移在HeLa和SiHa细胞中,通过Western Blot检测EMT途径相关生物标志物的表达量变化。敲低Rab31的表达后,上皮标志物E-cadherin表达量升高,间充质标志物N-cadherin,Vimentin,Snail和Slug表达均降低,降解细胞外基质的基质金属蛋白酶MMP2,MMP9表达降低,EMT途径受抑制,细胞侵袭转移能力减弱。细胞免疫荧光试验也表明,降低Rab31的表达后,E-cadherin表达量升高,Vimentin表达降低。而在过表达Rab31后,相关间质标志物表达升高,细胞向侵袭转移能力较强的间充质型转化,促进了癌细胞的侵袭和转移。另外,利用荧光标记的鬼笔环肽,对细胞肌动蛋白F-actin染色,荧光显微镜下观察到,下调Rab31的表达后,F-actin聚合减少,伪足形成减少,细胞迁移运动能力减弱。4.Rab31与MAPK6分子相互作用,共同促进宫颈癌的侵袭和转移CO-IP实验结果表明,Rab31和MAPK6分子之间存在相互作用。且Western Blot结果显示,干扰Rab31的表达后,MAPK6的蛋白表达量也降低。利用小干扰 si-MAPK 转染 HeLa,SiHa 细胞,干扰 MAPK6 的表达,CCK8 和 Transwell结果表明,干扰MAPK6后,癌细胞增殖速率减慢,侵袭和转移能力降低。我们在两种细胞中,分别在干扰Rab31的同时过表达MAPK6,发现MAPK6的过表达部分逆转了 Rab31低表达对细胞侵袭转移的抑制作用,说明Rab31对癌细胞侵袭转移的作用部分依赖于MAPK6分子。实验结论Rab31分子在宫颈癌组织和细胞中高表达,Rab31通过增加EMT相关间质标志蛋白的表达,降低上皮标志蛋白的表达,促进细胞外基质的降解,使细胞发生EMT。并通过减少F-actin的聚合,减少伪足形成,降低宫颈癌细胞的迁移运动。最后,我们证明Rab31与MAPK6相互作用,共同促进宫颈癌的侵袭和转移。