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鉴于乳酸的性质和应用,乳酸及聚乳酸的产业化已成为关注的热点,本文针对乳酸单体的发酵法生产工程化所遇到的问题,从基础研究出发系统地研究了拟干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)发酵生理代谢的基本特性;系统地研究了维生素和中和剂类型对L.paracasei生长和乳酸生产的影响;研究了膜分离耦合发酵的方法连续生产L-乳酸;改进了乳酸连续发酵过程的数学模型。具体结果如下:
建立了一种新型的乳酸浓度气相测定方法。在含有乳酸的发酵液中加入过量的高碘酸溶液和适量的内标(1.0﹪乙腈溶液)后,就可以直接采用GDX-103填充柱进行分离检测。分析条件为:汽化室温度140℃,柱温130℃,检测器温度160℃,进样量0.5μL,每个样品的整个分析过程只需5min。在乳酸浓度0.1-200g/L范围内都具有很好的检测效果。该方法具有样品前处理简单、干扰小、灵敏度高、分析速度快,线性测定范围宽等优点。
确定了摇瓶中L.paracasei的最适生长条件为:温度37℃,接种量20﹪,装液量为100mL/250mL三角瓶,转速为100r/min,L.paracasei的生长和产酸的最适pH均为6.0。在MRS培养基的基础上,优化了L.paracasei的种子制备培养基。最优的种子培养基配方确定为(g/L):蛋白胨10.0,葡萄糖40.0,酵母膏10.0,牛肉膏6.0,硫酸镁0.2,硫酸锰0.2,氯化钠0.03,硫酸亚铁0.01,醋酸钠4.0,柠檬酸二胺2.0,磷酸二氢钾2.0,吐温-801.0mL。使用优化后的种子培养基得到的菌体浓度要比采用MRS培养基提高了31.8﹪。
组合采用了两水平分式析因设计、最速上升法以及中心组合响应面方法,首次系统地研究了维生素B1、B2、B5、B6和H对L.paracasei的乳酸合成影响,并从酶学机理上予以分析,结果表明:在发酵液中添加维生素作为生长因子对菌的生长和乳酸的生产均有不同程度的促进作用,其中VB1和VH的作用显著。优化后的维生素最佳添加策略是:VB100.053mg/L,VB20.01mg/L,VBs4.0mg/L,VB60.2mg/L,VH0.075mg/L。在以硫酸铵为唯一氮源的培养基中添加最优的维生素组合后,乳酸的产量要比没有添加任何维生素的乳酸发酵提高92.7﹪。在发酵培养基(含有酵母膏、牛肉膏、蛋白胨等富营养成分)的基础上添加这些组合维生素,乳酸的产量可提高42.3﹪。另外酶学数据表明,维生素的添加可以提高糖代谢途径与乳酸合成相关途径的关键酶活性。添加优化的维生素后L.paracasei的糖酵解途径和同型乳酸发酵途径均得到了加强,耗糖水平不断提高,极大地促进了乳酸杆菌的初级代谢,同时也提高了乳酸生产效率。
在乳酸的生物发酵过程中,合理适时调控发酵液pH尤为重要。采用pH调控得到的乳酸浓度可达187.9g/L,是pH不调控的4.9倍。CaCO3粉末是一种缓慢型的酸中和剂,pH调节能力有限。在用L.paracasei发酵生产乳酸过程中,只能将pH维持在4.9~5.2。而氨水和NaOH溶液则可以很好地将发酵液的pH调控在最优值6.0。
建立了一套新型的细胞循环式膜生物反应器系统。与其它传统的细胞循环式膜反应器相比,该反应器不仅能获得较高的细胞浓度和乳酸生产速率,而且更加稳定和耐久。在运转期间可以很方便地在线对膜组件进行清洗和消毒,因此只要在细胞活力和生理状态允许的情况下,理论上此套膜生物反应器可以周期性地长久运行下去。利用这套细胞循环膜反应器连续发酵生产乳酸,得到的乳酸生产速率和OD620可达到31.5g/(Lh)和98.7,分别是补料发酵的10倍和6倍,持续稳定运转时间超过155h。
L.paracasei的细胞循环式连续发酵过程的模型必须要体现四个方面:底物浓度过高或过低带来的抑制或限制作用、乳酸的反馈抑制作用、高细胞浓度带来的细胞群体之间生存竞争效应和连续培养过程中由于大量富营养性培养基的流加而带来的生长促进效应等。本文通过引入了两个重要参数——环境条件因子系数β和生存竞争因子系数α来表征乳酸连续发酵的过程,改进后的模型能够很好地拟合和预测了整个发酵过程。并且我们发现乳酸菌的生长浓度有一个临界值,一旦超过这个临界值时,细胞群体就存在相互胁迫,从而导致菌体的活力下降,产酸能力也减弱,那么再继续简单增加细胞的浓度就并不能有效带来乳酸产率的增加。