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本文以人胃癌MKN45细胞为研究对象,建立MKN45细胞滚瓶培养模型,对其进行工程化扩大培养。在建立了工程化培养模型后,将MKN45细胞与硒酸壳聚糖进行共培养,探究其对MKN45细胞的增殖抑制作用以及诱导凋亡的作用机制。通过单因素及正交试验探究细胞接种量、培养时间、培养液用量和贴壁后转速对MKN45细胞大规模培养的影响,结果显示,在所有探讨的培养条件中细胞接种量最为关键,影响最大。滚瓶培养MKN45细胞的最佳条件为:细胞接种量5×107个/瓶,培养液用量200 mL,培养时间72 h,贴壁后转速20 r/h。在建立了 MKN45细胞滚瓶培养模型后,本实验进一步探究了硒酸壳聚糖诱导MKN45细胞凋亡的作用机制。首先,验证硒酸壳聚糖诱导MKN45细胞凋亡的发生。MTT实验结果表明,硒酸壳聚糖能抑制MKN45细胞的增殖,且当作用浓度2000μg/mL、培养时间为72h时其作用效果显著,细胞增殖抑制率可达到80%以上;扫描电镜以及Hoechst33342/PI双染均观察到200 μg/mL的硒酸壳聚糖能诱导MKN45细胞出现如体积缩小、染色质凝集、核固缩以及形成凋亡小体等典型的凋亡特征,从形态学方面验证了硒酸壳聚糖对MKN45细胞的诱导作用;Annexin V-FITC/PI双染结合流式检测证明,硒酸壳聚糖作用后可诱导MKN45细胞逐渐由早期凋亡走向晚期凋亡,且该过程明显依赖于作用时间;此外,细胞周期的检测结果表明硒酸壳聚糖破坏了 MKN45细胞分裂周期的连续性,并将其阻滞在S期。其次,探究了 MKN45细胞在硒酸壳聚糖诱导下的凋亡信号途径。流式细胞术检测硒酸壳聚糖作用下MKN45细胞活性氧以及线粒体膜电位的变化,结果显示,经硒酸壳聚糖作用后,MKN45细胞内活性氧水平明显升高且其线粒体膜电位显著降低,这说明硒酸壳聚糖可诱导MKN45细胞凋亡,凋亡的发生与线粒体有关。再次,通过检测相关凋亡蛋白进一步验证凋亡途径。通过SDS-PAGE以及蛋白免疫印迹(Westernblotting)技术分析了 MKN45细胞经硒酸壳聚糖作用不同时间后,相关凋亡蛋白的表达情况,发现硒酸壳聚糖可通过影响MKN45细胞内Bcl-2、Bax蛋白的表达改变线粒体膜的通透性,使细胞跨膜电位消失,从而导致细胞色素C的释放,继而激活Caspase-9、3,最终导致细胞凋亡。综上所述,硒酸壳聚糖对MKN45细胞的增殖有明显抑制作用,并可以通过线粒体途径诱导其发生凋亡,因此,它是一种很有潜力的抗癌活性物质。