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研究背景和目的急性心肌梗死（AMI）后随之出现的左心功能不全和心脏衰竭,具有较高的发病率和死亡率[1]。心梗后临床干预措施是有效地打开闭塞的血管和重建冠状动脉血流,如血管成形术或溶栓药物。然而,其对减轻缺血期或再灌注时的心肌损伤疗效不确切。大量的研究已经证实,线粒体酶乙醛脱氢酶-2（ALDH2）是一种参与保护心脏的关键酶,它通过介导激活醛,如乙醛和4-羟基-2-壬烯醛（4-HNE）的解毒以及硝酸甘油的生物活化（GTN）[2,3]而发挥作用。过度表达的ALDH2野生型酶可对心脏组织和心脏功能产生多种有益的影响。高表达的ALDH2可保护心脏免受乙醛的毒性和急性乙醇中毒所致心肌损害[4,5]。在ALDH2基因敲除小鼠中不能检测出ALDH2的酶活性,乙醇灌胃后乙醛的水平明显升高,因此,这种小鼠对酒精和乙醛引起的毒性和损害比野生型小鼠更敏感[6,7]。既往的实验和临床研究已经发现,ALDH2惰性的人比ALDH2功能正常的人食用酒精或/和吸入乙醛有更高的风险。ALDH2缺陷之人习惯性饮酒有较高的患癌症的风险[8-10]。然而,ALDH2野生型基因的具体调节机制尚不清楚。微小RNA（miRNAs）长度为二十几个核苷酸的非编码调控RNA家族,是由一系列RNaseⅢ内切酶和转运蛋白等逐步加工完成。miRNAs通过与靶mRNA 3’-UTR区完全或部分互补结合,导致靶mRNA降解或转录后翻译抑制,从而调控靶基因的表达。miRNAs的主要生物学功能是对基因表达进行转录后调控。但是,miRNAs是否参与ALDH2基因调控尚不清楚。许多由miRNA调控的蛋白质编码基因目前尚未被证明。生物信息学方法可能有助于识别它们。本课题组前期通过生物信息学比对miRNAs的调控靶基因,发现ALDH2可能是miR-28的一个靶基因。但是的mir-28调控小鼠ALDH2表达尚未报道。本研究拟证明miR-28靶向调控ALDH2的作用,探讨了 miR-28促进小鼠心肌缺血损伤的机制,以及补阳还五汤对心肌的保护作用。方法1.miR-28靶基因分析利用 TargetScan 5.1（http://targetscan.org/）,PicTar（http://pictar.mdc-berlin.de/）,和miRanda（http://microRNA.org）等多种生物信息分析法,预测miR-28的靶基因,然后用miR-28前体分子瞬时转染心肌细胞株,通过荧光素酶活性实验、表达分析等功能性实验进行靶基因的验证。2.miR-28功能研究采用miR-28前体分子瞬时转染心肌细胞株,四唑盐比色实验（MTT实验）和克隆集落形成实验、细胞凋亡、蛋白印迹实验等测定细胞生存率和基因表达情况,探讨miR-28调控ALDH2的机制。3.补阳还五汤通过ALDH2保护缺血小鼠心肌细胞采用蛋白印迹、细胞凋亡等方法,探索补阳还五汤是否通过ALDH2对小鼠心肌细胞的保护作用。结果1.ALDH2是miR-28的靶基因我们综合利用microRNA,TargetScan,和PicTar algorithms生物学分析软件预测其潜在的靶基因。经比对分析,microRNA,TargetScan,均显示ALDH2是miR-28的潜在靶基因。提取小鼠心肌细胞的总蛋白,Western blot法检测ALDH2蛋白的表达。结果发现:ALDH2蛋白在小鼠心肌细胞中表达随乏氧时间的延长而降低,其中乏氧24h细胞ALDH2表达最低。转染miR-28后,细胞的ALDH2蛋白表达水平与对照组相比分别降低了53%;而转染miR-28抑制物后细胞ALDH2蛋白表达较阴性对照组增加了 1.8倍。结果表明,小鼠心肌细胞株中miR-28下调ALDH2的表达。为了进一步证实ALDH2 mRNA的3’UTR区是miR-28的功能性靶点,我们克隆了 ALDH2 3’UTR区106 bp大小片段,构建荧光报告质粒载体pGL3-ALDH2载体,然后与miR-28、miR阴性对照共转染入293T细胞,pRL-TK被用来对转染效率做标准化。与阴性对照组比较,共转染pGL3-ALDH2和miR-28的293T细胞荧光酶活性减少了 40%,差异有统计学意义（P<0.001）。综合蛋白印迹和荧光素酶活性检测结果,我们提出小鼠心肌细胞中ALDH2 3’-UTR是miR-28的一个作用靶点。2.miR-28通过ALDH2调控心肌细胞凋亡通过MTT法,检测了 miR-28对小鼠心肌细胞体外增殖能力的影响,通过4天的比较,与阴性对照组1前体分子相比,miR-28过表达小鼠心肌细胞增殖速度在乏氧条件下细胞增殖速度均明显减慢,差异具有显著性（F=11.101,P=0.000）。结果表明,在缺氧条件下,miR-28基因的导入明显抑制了小鼠心肌细胞的体外增殖。miR-28转染后的心肌细胞凋亡显著增加,乏氧条件下,miR-28过表达组较对照组的心肌细胞凋亡增加了 55%,而miR-28沉默后心肌细胞凋亡降低了41%。利用Western blot法进一步验证ALDH2蛋白表达情况,结果亦显示:在乏氧条件下,转染miR-28后的小鼠心肌细胞中的ALDH2蛋白表达水平与对照组相比分别降低了54%。以上结果表明,小鼠心肌细胞株中miR-28下调ALDH2的表达。3.补阳还五汤通过ALDH2保护缺血小鼠心肌细胞应用RT-PCR检测细胞株ALDH2基因的表达,补阳还五汤能升高ALDH2的mRNA的表达。在乏氧条件下补阳还五汤处理后的小鼠心肌细胞中的ALDH2蛋白表达水平与对照组相比明显升高。补阳还五汤可使小鼠心肌细胞株中ALDH2的表达上调。补阳还五汤能明显降低小鼠心肌细胞凋亡,乏氧条件下,补阳还五汤组较对照组的心肌细胞凋亡降低了 26.5%。结论1.经生物学分析软件比对发现,microRNA,TargetScan均显示ALDH2是miR-28的潜在靶基因。Western blot和荧光素酶活性检测结果表明,心肌细胞中ALDH2 3’-UTR是miR-28的一个靶点。2.缺氧条件下,miR-28基因的导入明显抑制了小鼠心肌细胞的体外增殖。在乏氧条件下,转染miR-28后的小鼠心肌细胞中的ALDH2蛋白表达水平与对照组相比分别降低了 54%。miR-28转染后的心肌细胞凋亡显著增加,乏氧条件下,miR-28过表达组较对照组的心肌细胞凋亡增加了 55%,而miR-28沉默后心肌细胞凋亡降低了 41%。3.补阳还五汤能升高ALDH2的mRNA及蛋白的表达。补阳还五汤能明显抑制小鼠心肌细胞凋亡,乏氧条件下,补阳还五汤组较对照组的心肌细胞凋亡降低了 26.5%。本文创新之处1.小鼠心肌细胞中ALDH2 3’-UTR是miR-28的作用靶点之一。2.miR-28通过抑制ALDH2的表达促进小鼠心肌细胞的缺血损伤。3.补阳还五汤能有效减轻心肌细胞缺血损伤。