第一部分酒精性肝病组织特异性miRNAs表达谱及下游调控基因研究背景酒精性肝病(ALD)是全球性慢性肝病的主要病因之一,常造成广泛的肝损伤,其范围包括单纯脂肪变性(AFL),酒精性脂肪性肝炎(ASH),肝纤维化,肝硬化甚至肝细胞癌。虽然脂肪变性是一种几乎完全良性的疾病,但是酒精性肝硬化与死亡率显著相关,预期寿命缩短。美国2007年最新监测报告显示,肝硬化是美国第12大死因,与酒精相关率达48%。在中国,我们的流行病学研究表明,浙江省ALD的患病率是3.94%。因此,开发有效的ALD的诊治工具具有重要临床意义。新证据提示,miRNAs的异常表达将导致酒精性肝损伤的发展。例如,Tang等报道,乙醇诱导miR-212超表达,通过下调一个结合部位的主要成分ZO-1导致肠道通透性增加,而肠道通透性是ALD的一个关键病理生理因素。Yin等研究表明,慢性乙醇暴露将特异性诱导AML-12肝细胞和老鼠的肝脏中miR-217超表达,然后抑制肝脏SIRT1表达,最终导致肝细胞的脂肪堆积。用乙醇处理正常的人类肝细胞(N-Heps)和胆管细胞,会诱导miR-34a的表达显著增加,而miR-34a的超表达通过调节靶目标caspase-2和SIRT1减少乙醇诱导的凋亡。在乙醇饲养的老鼠的肝脏中miR-155和miR-132表达增加,与孤立肝细胞和枯否细胞中的表达增加一致。此外,最近不少研究运用微阵列方法研究ALD的niRNAs的表达谱。Liu等在ALD患者中发现了26个miRNAs.进一步研究miRNA-基因网络显示,关键的miRNAs是hsa-miR-570, hsa-miR-122, hsa-miR-34b, hsa-miR-29c, hsa-miR-922和hsa-miR-185,后者负向调控大约79个下游靶基因以调节肝细胞免疫反应,炎症反应和谷胱甘肽代谢。同时慢性乙醇饲养改变了肝再生期间一些miRNAs的表达,包括niR-34a, miR-103, miR-107, miR-122和miR-21. Dolganiuc等研究发现与配对饲养的对照组相比,Lieber-deCarli酒精饮食上调酒精性脂肪性肝炎大鼠已知miRNAs的1%(如miR-705和miR-1224)和下调1%(如miR-182, miR-183和miR-199a-3p)。这些发现对ALD的诊断和治疗提供了有价值的线索。然而,区分ALD的不同阶段中单纯性脂肪肝和酒精性脂肪肝炎的miRNAs的表达谱尚未报道。材料和方法48只Sprague-Dawley大鼠(12周,160g-170g)随机分为四组：C12,AFL,C16和ASH. AFL和ASH大鼠用北京二锅头灌胃制模(浓度56%的酒精和17.86ml/kg每天一次),对照组给予生理盐水。12周和16周结束日大鼠股血管放血,常规检测血清ALT、AST、TG、GGT、TCh和肝脏TG含量。肝脏组织切片H-E染色,由奥林巴斯显微镜观察肝脂肪变性和炎症。应用微阵列初筛和茎环RT-PCR验证的方法检测ALD大鼠模型中异常表达的miRNAs.再以微阵列显著性分析(SAM)和微阵列预测分析(PAM)计算显著异常表达的miRNAs。TargetScan、miRanda和PicTar共同用来预测miRNAs的靶基因。最后通过"DAVID"平台对这些靶基因进行GO功能分类和KEGG通路分析。结果ALD不同阶段的AFL和ASH大鼠模型成功建立,并经血清学和病理变化证实。微阵列芯片和茎环RT-PCR结果,ASH组与对照组相比,有16个miRNAs上调和13个miRNAs下调,而niR-129和miR-199a-3p处于上调和下调miRNAs的最前列。AFL组和对照组相比,有5个miRNAs上调和8个miRNAs下调,而miR-200c*和niR一93处于上调和下调miRNAs的最前列。通过SAM和PAM进一步分析发现,区分ASH组和对照组的特异性miRNAs表达谱由6个下调miRNAs(miR-199a-3p,miR-214,miR-93,miR-146a,miR-191和let-7b)和6个上调rniRNAs(miR-129,miR-490,miR-21*,miR-503,miR-183和miR-185*)组成。区分AFL组和对照组的特异性miRNAs表达谱由5个下调miRNAs(miR-93,miR-451,miR-221*,miR-17-5p和miR-146a)和3个上调niRNAs (miR-200c*,miR-490和miR-195*)组成。通过靶基因预测分析发现,ASH组的下调miRNAs和上调miRNAs的靶基因分别为8个和61个,而AFL组的下调miRNAs和上调miRNAs的靶基因分别为20个和152个结论ASH的特异性miRNAs表达谱为6个下调miRNAs(miR-199a-3p,miR-214, miR,93,miR-146a,miR-191和let-7b)和6个上调niRNAs(miR-129,miR-490, miR.21*,miR-503,miR-183和miR-185*).AFL的特异性miRNAs表达谱为5个下调niRNAs(miR-93,miR-451,miR-221*,miR-17.5p和miR.146a)和3个上调miRNAs(miR.200c*,miR.490和miR-195*).ASH的下调niRNAs和上调miRNAs的靶基因分别为8个和61个,而AFL的下调miRNAs和上调miRNAs的靶基因分别为20个和152个第二部分酒精性脂肪性肝炎血清潜在miRNAs标志物研究背景酒精性肝病(ALD)被认为是肝硬化的主要原因之一,它包括酒精性脂肪肝、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、肝纤维化和肝硬化。ALD的发病机制涉及到酒精及其代谢产物对肝细胞的影响,活性氧的诱导,炎症级联反应的激活和肠道通透性的失衡。ASH一直被视为ALD病程中最重要的阶段,因为它通常是不可逆转的,且造成肝硬化和肝细胞癌的风险大大增加。鉴于ALD全球增加的患病率及其在中国的高发率,因此,找到合适的诊断ASH的标志物具有重要临床意义。miRNAs在所有多细胞生物均被发现且呈多样性,并发挥重要的生物功能。例如,组织niRNAs的异常表达,作为潜在的诊断工具,在人类癌症、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)等疾病中被广泛报道。既往的miRNAs研究主要基于组织水平。最近报道,血清和其他体液含有足够稳定的miRNAs印迹。因此,基于这一发现,学者研究了一些疾病包括癌症、药物性肝损和炎症的循环miRNAs.然而,迄今尚无ASH特异性循环]miRNAs的研究。材料和方法Sprague-Dawley大鼠(12周,160-170g)被随机分为两组：ASH组(和对照组。ASH组大鼠用北京二锅头灌胃制模(浓度56%的酒精和17.86ml/kg每天一次)对照组给予生理盐水。16周结束日大鼠股血管放血处死。常规检测血清ALT、AST,TG和肝脏TG含量；肝脏组织切片Haematoxylin-Eosin染色,由奥林巴斯显微镜观察和评估肝脂肪变性和炎症。以TRIzol试剂盒和niRNeasy试剂盒按照说明书常规提取组织和血清RNA。以Axon GenePix4000B微阵列扫描仪扫描芯片。得到的图像以GenePix Pro6.0software软件进行分析。以实时定量逆转录PCR验证芯片所发现的特异性改变的miRNA.对PCR所得到的原始-△CT结果通过log2转化实现数据正态化分布后,再分别SAM和PAM进行深入的生物信息学分析。联合应用miRNA-靶基因预测的开放进入平台(http://www.microrna.org/microrna/home.do)和靶基因扫描(http://www.targetscan.org/)生成miRNAs靶基因。然后,搜索GO分类和KEGG通路以研究靶基因功能注释和通路。结果ASH大鼠模型成功建立,并经血清学和病理变化确认。ASH组血清和对照组相比,有25个上调和7个下调miRNAs,而ASH组肝组织和对照组相比,有20个上调和14个下调miRNAs。MiRNA-208b-3p和miRNA-455*在血清中变化最大,而miRNA-129和miRNA-199a-3p在肝组织中变化最大。然而,只有4个miRNAs (miR-490, miR-185*, miR-199a-3p和miR-214)在血清和肝组织中均有显著改变。为了缩小miRNAs范围,基于qRT-PCR的原始数据应用SAM分析发现ASH组和对照组相比,分别有18个上调血清niRNAs和5个下调血清miRNAs.进一步应用PAM方法发现区分ASH组和对照组的特异性miRNAs表达谱分别由8个上调和3个下调miRNAs组成。进一步以GO功能分类和KEGG通路对SAM结果进行分析。共122个GO功能分类和144个KEGG通路在上调miRNAs中显著富集,其中离子运输、蛋白质运输、凋亡过程、脂质代谢过程和脂肪酸代谢过程是在GO功能分类的前列,而MAPK信号通路、PPAR信号通路、胰岛素信号通路和氧化磷酸化在KEGG通路的前列。同样,86个GO功能分类和104个KEGG通路在下调miRNAs中显著富集。其中,脂肪酸代谢、脂类代谢、细胞凋亡和胰岛素信号通路也位于前列。结论区分ASH组和对照组的特异性的血清miRNAs表达谱,由8个上调miRNAs (rno-miR-539,rno-miR-490, rno-miR-484,rno-miR-135b, rno-miR-466c, rno-miR-208b-3p, rno-miR-761和rno-miR-384-5p)和3个下调miRNAs (rno-miR-214,rno-miR-203和rno-miR-199a-3p)组成。