【摘 要】
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由于与人的基因高度同源,猕猴是与人最为相近的模式动物,其脑组织的神经元及血管等结构信息解析对探究学习与记忆等高级脑功能至关重要。光学成像是获取脑组织高分辨结构信息的有效手段,但光在生物组织中的强散射使得研究者难以获取完整猕猴脑的神经元及血管等精细结构图像。对组织进行机械切削并对表层成像,避免了厚组织成像存在的强散射效应,是获取完整猕猴脑高分辨率图像的有效方法。为了实现切削,需对猕猴脑进行包埋处理,
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由于与人的基因高度同源,猕猴是与人最为相近的模式动物,其脑组织的神经元及血管等结构信息解析对探究学习与记忆等高级脑功能至关重要。光学成像是获取脑组织高分辨结构信息的有效手段,但光在生物组织中的强散射使得研究者难以获取完整猕猴脑的神经元及血管等精细结构图像。对组织进行机械切削并对表层成像,避免了厚组织成像存在的强散射效应,是获取完整猕猴脑高分辨率图像的有效方法。为了实现切削,需对猕猴脑进行包埋处理,然而现有的样本包埋方法多用于小鼠脑。由于猕猴脑体积是小鼠脑的两百倍左右,且结构极其复杂,适用于猕猴脑的大体积样本包埋方法研究还未见报道。因此,亟需发展大体积样本的包埋方法,保存组织精细结构和荧光信号。此外,该方法还需结合机械切削对组织表层成像,从而避免光在深层组织中的强散射,实现猕猴脑三维高分辨结构信息获取。针对这些需求,本文开展了以下研究:（1）在长时间光学成像过程中保持生物组织精细结构和荧光信号的水凝胶包埋策略研究。通过对比不同类型水凝胶自身稳定性及与生物组织交联程度,选择丙烯酰基甘氨酰胺（N-acryloyl glycinamide,NAGA）作为水凝胶单体,并确定了基本包埋参数。通过X射线断层成像等测评了组织包埋后的结构保持效果,发现包埋的生物样本的三维尺寸90天内无明显变化;共聚焦显微成像证明了神经元和血管长度及分支角度在包埋后无明显变化;染色实验显示包埋组织的核酸染色效果较好,可显示清晰的细胞结构。为了增强水凝胶包埋样本的荧光保持效果,提高弱荧光信号保持率,本文进一步研究了荧光标记物的荧光保持率与引发剂的引发条件、溶液酸碱性和氧化还原性之间的关系,确定了反应温和的偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐作为引发剂,并优化了聚合温度,将GFP、YFP、td Tomato荧光强度提升至包埋前的200%以上,提高了荧光图像的信背比,包埋方法还可兼容多种荧光探针。（2）适用于完整器官三维连续成像的水凝胶包埋策略研究。通过分析水凝胶力学性能和切削特性的对应关系,增加了交联剂NN-亚甲基双丙烯酰胺并优化了各成分配比,构建了合适的水凝胶聚合体系。台阶仪测试显示水凝胶切削表面平整度为2～4μm,满足逐层切削和三维连续成像的要求。基于该方法利用三维高分辨光学成像系统研究了小鼠脑精细的神经元环路结构和血管拓扑结构。为了增加组织透明度以提升成像速度,建立了机械切削结合组织透明的包埋方法,增加了脑组织透光率,成像深度也从50μm增加至150μm以上,节省了约1/2的成像时间。（3）猕猴脑水凝胶包埋和三维高分辨结构信息获取。确定了水凝胶溶液用量和渗透时间,使猕猴脑渗透充分;提出了琼脂糖-生物样本-水凝胶交联的聚合方式以增加样本与包埋剂的交联程度,增强样本长时间成像的稳定性;30天的切削成像测试证明样本切削平整,长时间成像焦面不会偏移。利用大体积样本的三维高分辨成像系统,对三维尺寸为75×55×45 mm~3的猕猴脑进行了60天的图像采集,获取了0.32×0.32×10μm~3体素分辨率的猕猴脑构筑信息,显示出不同的细胞和血管形态结构。获取了0.65×0.65×3μm~3体素分辨率猕猴半脑三维连续的神经元投射信息,解析了从皮层到丘脑的投射路径,并重建了单神经元。研究发现皮层5b层的锥体束神经元轴突可能投射到背中部丘脑并形成簇状轴突终端。本文所发展的水凝胶包埋方法实现了完整猕猴脑精细结构的荧光信号获取,证明了该包埋方法对样本精细结构和荧光信号的长时间、稳定保持。且包埋样本的力学性能可调节,满足了大体积样本三维成像中对组织切削性能的需求。相较于现有的应用于鼠脑尺寸样本的包埋和成像,该方法大大拓展了全脑光学成像应用范围,实现了猕猴脑样本包埋和三维高分辨结构信息获取,为非人灵长类介观脑图谱研究提供了一种高效方案。
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