1、研究目的与意义:最近的一系列研究结果表明,世代生活在青藏高原的现代藏族人群的祖先早在3万多年前就已成功定居在青藏高原,并开始发展对高原低氧极端环境的生理适应,经过一代代连续的自然选择,最终获得了对高原低氧极端环境的最佳生理适应性,但藏族人群对高原低氧环境适应的分子机制仍然是未解之谜。我们与其它实验室的前期研究结果表明,低氧诱导因子2α(HIF-2α,其编码基因为EPAS1)及其负调控因子PHD2(其编码基因为EGLN1)可能在藏族人群对高原低氧环境的长期适应中发挥关键作用,但其在低氧通路中的生物学功能及其调控机制仍然不清楚。我们的研究结果发现EGLN1基因上极度保守的非同义突变位点D4E和C127S在藏族人群中的频率(70.9%),显著地高于包括汉族在内的平原人群(<1%),且与藏族人群中相对较低的血红蛋白浓度呈正相关,提示这两个突变位点可能是藏族人群对高原低氧长期适应的潜在功能位点,但是这两个位点是如何影响PHD2功能的分子机制还不清楚。为了系统研究藏族高原适应关键基因的功能效应,验证这两个基因各自及其互作的机制,我们重点选择藏族新生儿脐带内皮细胞和定点突变小鼠的人工低氧诱导实验,并结合高原藏族人群与平原汉族人群的离体胎盘组织的表达谱分析,旨在阐明藏族人群中HIF-2α和PHD2的潜在功能位点对高原低氧环境适应的分子调控机制。研究结果对最终揭示人类对高原低氧环境适应的遗传基础提供重要的数据。2、研究方法:本研究采用非线性拟合模型分析藏族关键表型——较低的血红蛋白浓度,结合基因型-表型遗传相关性分析、比较基因组学、细胞生物学、ATAC-seq、CRISPR/Cas9基因编辑系统和人工低氧诱导实验等手段从体内外验证藏族人群富集的EPAS1和EGLN1基因高原适应的遗传突变位点功能,探讨EPAS1和EGLN1基因对藏族人群高原低氧适应的分子机制及其功能后果。3、研究结果:(1)通过对不同海拔藏族群体血红蛋白的非线性拟合分析发现海拔4500米左右代表了藏族人群血红蛋白浓度和红细胞增多症患病率大幅度增长的转折点,这意味着藏族人群通过调控血红蛋白浓度来适应高原低氧环境的调控机制在4500米以上的极限高海拔低氧环境中可能不再有效;(2)通过对EPAS1的系统研究发现藏族富集的EPAS1突变位点下调了EPAS1在脐带内皮细胞和胎盘中的表达水平;杂合EPAS1基因敲除小鼠表现出与高原藏族人群相似的对慢性低氧的钝化生理反应。除此之外,我们还发现EPAS1除了下调藏族人群在高原低氧环境中的血红蛋白水平外,可能还参与下调藏族人群的肺动脉压,进而实现对高原低氧环境的长期适应;(3)通过对EPAS1、EGLN1基因的互作研究发现脐带内皮细胞在低氧1-3天转录组和染色质开放程度都发生明显改变,适应型细胞系的转录组变化幅度和染色质开放程度都比野生型细胞系小,呈现钝化反应;差异表达基因中出现很多与神经发育和神经细胞分化相关的基因和通路;(4)采用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建PHD2-D4E定点突变小鼠。4、创新性:本研究首次采用非线性拟合方法分析藏族高原适应的海拔转折点,结合细胞水平、基因编辑动物水平的低氧诱导功能实验,以及大规模藏族人群生理表型的遗传相关分析等诸多手段分析藏族人群高原适应的遗传基础,是迄今解析高原低氧适应关键基因的功能效应、分子通路及基因间互作机制的最为系统的研究。研究结果将有助于设计出提高人体应对低氧反应的药物,缓解和降低高原病的发生,为高原病预防及治疗提供基础数据。