牛肠激酶是一种丝氨酸蛋白酶,因为具有较强的特异性和较宽的活性范围,而在基因工程中得到广泛应用,对蛋白药物的研发也起着重要作用。本论文构建牛肠激酶轻链大肠杆菌表达菌株后发酵生产,经过多步纯化后得到重组牛肠激酶轻链蛋白,并对其酶比活性测定方法进行了研究。构建表达质粒pET39b-BEK,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)中,经筛选鉴定得到阳性工程菌株后,发酵培养并诱导表达。每10 L发酵液能得到约250 g湿菌体,经电泳检测,目的蛋白主要出现在包涵体中。破碎菌体后收集包涵体,取5 g湿包涵体进行复性,并用亲和层析、分子排阻层析和阴离子交换层析等方法纯化蛋白。最终得到约220mg目的蛋白,即折合每升发酵液可得到纯化后的目的蛋白220mg左右。对纯化后的目的蛋白进行检测,蛋白含量约0.92mg/mL,纯度大于95%,酶比活性约为55000U/mg。分别使用两步法和荧光底物法检测纯化产品酶比活性。发现两步法操作繁琐,结果不精确,而荧光底物法操作简单,结果较佳,因此选择荧光底物法作为目的蛋白酶比活性检测方法。优化的荧光底物法反应条件为孵育温度25℃、缓冲液pH值8.0,并对荧光底物法进行了方法学验证,证明此方法稳定可靠。又对比了荧光底物法与以公司自制融合蛋白为底物的电泳法,建立了荧光底物法表示的酶比活性与电泳法表示的酶比活性的联系,使得用荧光底物法检测酶比活性的重组牛肠激酶轻链蛋白可用于融合蛋白的酶切。